非小細胞肺癌中PDGF-BB表達及其與骨轉移的相關性

任鵬飛，王 弦，李晶晶，琚 倩，孟晨旭，龍其河，金像婷，李煩繁

肺癌是我國發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]，確診時約50%已為晚期，骨是其主要的轉移部位之一，約40%患者可發(fā)生骨轉移，肺癌骨轉移后患者的中位生存時間僅為6～10個月，經(jīng)過治療后1年生存率也僅為40%～50%，且嚴重影響患者的生活質量[2]。目前，影像學和骨代謝標志物對于骨轉移的發(fā)現(xiàn)多數(shù)只能在骨轉移發(fā)生和進展時，存在一定的滯后性。因此，發(fā)現(xiàn)NSCLC骨轉移發(fā)生、發(fā)展過程中的關鍵因子，對于骨轉移發(fā)生發(fā)展的早期預測，以及患者的治療和預后具有重要意義。本組前期研究發(fā)現(xiàn)：2例PDGF-BB陽性NSCLC患者在后續(xù)隨訪中發(fā)生骨轉移的時間，較PDGF-BB陰性者早，提示PDGF-BB可能作為NSCLC骨轉移的預測指標[3]。本組在前期研究基礎上，進一步分析PDGF-BB在NSCLC患者血清及組織中的表達情況，探究其與遠處轉移(尤其是骨轉移)的關系，為預測NSCLC骨轉移的發(fā)生及預后提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年1月～2019年12月安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院病理確診為NSCLC，經(jīng)影像學檢查證實已發(fā)生遠處轉移、隨訪資料和組織標本完整的86例NSCLC作為轉移組，其中61例發(fā)生骨轉移納入骨轉移組，25例發(fā)生除骨轉移外的其他部位遠處轉移納入除外骨轉移的遠處轉移組。另選取56例同期診斷為NSCLC、未發(fā)生遠處轉移的標本作為無轉移組。兩組患者年齡、性別、腫瘤大小及病理類型之間差異無統(tǒng)計學意義。87例血液樣本取自2019年10月～2021年1月經(jīng)病理確診、未經(jīng)治療的NSCLC患者。根據(jù)患者的入院分期檢查將血液標本分為三組，(1)骨轉移組：發(fā)生骨轉移；(2)除外骨轉移的遠處轉移組：除骨轉移外的其他部位遠處轉移；(3)無轉移組：未發(fā)生遠處轉移。

1.2 主要試劑PDGF-BB酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購于武漢伊萊瑞特公司，兔抗人PDGF-BB(bs-1316R)多克隆抗體購自北京博奧森公司，羊抗鼠/兔二抗、免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。其余主要試劑如乙醇、二甲苯等均為市購分析醇。

1.3 方法

1.3.1ELISA測定 所有患者在接受治療前于清晨空腹抽取，取靜脈血5 mL至普通離心管或采血管(采血管中不含抗凝劑、防腐劑或分離劑)，4 ℃放置30～45 min，3 000～5 000 r/min離心10 min，取上清檢測或保存在-80 ℃低溫冰箱。嚴格按照說明書的要求進行操作。分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔，向相應的孔中加入稀釋好的標準品或血清樣品，每個標準品及樣品均設置復孔，每孔100 μL。37 ℃溫育90 min，棄去液體，甩干。每孔加生物素化抗體工作液100 μL，37 ℃溫育1 h，洗板3次。每孔加酶結合物工作液100 μL，37 ℃溫育30 min，洗板5次。每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色。每孔加50 μL終止溶液終止反應。用酶標儀在450 nm波長測量各孔的OD值，根據(jù)酶標儀所測標準品OD值及對應濃度，制作出標準曲線及回歸方程式，將樣本的OD值代入方程，計算出樣本濃度，乘以稀釋倍數(shù)，得出血清中PDGF-BB的實際濃度。

1.3.2免疫組化 免疫組化染色采用SP法。將石蠟包埋組織4 μm厚切片、烘干、烤片，脫蠟水化，檸檬酸緩沖液(pH 6.0)高壓抗原修復，自然冷卻，加入內源性過氧化物酶阻斷劑，滴加一抗PDGF-BB(1 ∶400)，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗5 min×3次，加入二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，分化，沖洗反藍，脫水，透明，封固。鏡下觀察蛋白表達情況并拍照。

1.4 結果判斷PDGF-BB定位于細胞核及細胞質。(1)按著色腫瘤細胞所占比例評分：陽性細胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。(2)根據(jù)染色強度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結果相乘：0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為陽性，9～12分為強陽性；結果由兩位資深病理醫(yī)師采用雙盲法進行判定。

1.5 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量數(shù)據(jù)采用t檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗或確切概率法。生存分析采用Log-rank檢驗并行Kaplan-Meier生存曲線進行單因素生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC患者血清中PDGF-BB的表達情況NSCLC骨轉移組、除外骨轉移的遠處轉移組、無轉移組患者的血清標本分別為23例、26例、38例。血清中PDGF-BB的濃度均數(shù)在骨轉移組、除外骨轉移的遠處轉移組、無轉移組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，表1)。骨轉移組和除外骨轉移的遠處轉移組患者血清中PDGF-BB的濃度均高于無轉移組(P<0.05)，而骨轉移組PDGF-BB濃度高于除外骨轉移的遠處轉移組，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.077，圖1)。

表1 三組患者血清中PDGF-BB濃度

圖1 三組NSCLC患者血清中PDGF-BB濃度

2.2 NSCLC中PDGF-BB表達與臨床病理特征的關系PDGF-BB在NSCLC組織中同時表達于細胞質和細胞核(圖2)。142例NSCLC中PDGF-BB的陽性率為52.11%(74/142)，其中轉移組患者的PDGF-BB陽性率為65.12%(56/86)，高于無轉移組(32.14%，18/56)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TNM分期Ⅲ期患者的PDGF-BB陽性率為70.00%(21/30)，明顯高于Ⅰ期(33.33%，11/33)和Ⅱ期(53.16%，42/79)患者(P<0.05)；有區(qū)域淋巴轉移患者的PDGF-BB陽性率為65.15%(43/66)，高于無區(qū)域淋巴轉移患者(40.79%，31/76，P<0.05)。PDGF-BB表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、病理類型均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，而與病理分期、區(qū)域淋巴結轉移、遠處轉移有關(P<0.05)。

圖2 NSCLC中PDGF-BB的表達：A．PDGF-BB在鱗狀細胞癌組織中呈陰性，SP法；B．PDGF-BB在鱗狀細胞癌組織中呈陽性，SP法；C．PDGF-BB在腺癌組織中呈陰性，SP法；D．PDGF-BB在腺癌組織中呈陽性，SP法

2.3 NSCLC骨轉移組和除外骨轉移的遠處轉移組中PDGF-BB的表達86例轉移組患者中，骨轉移61例(70.93%)，除外骨轉移的遠處轉移25例(29.07%)。骨轉移組PDGF-BB陽性率為75.41%(46/61)，高于除外骨轉移的遠處轉移組(40.00%，10/25)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002，表3)。

表2 非小細胞肺癌中PDGF-BB表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

表3 骨轉移組和除外骨轉移的遠處轉移組PDGF-BB表達情況[n(%)]

2.4 骨轉移組PDGF-BB表達與無骨轉移生存時間(bone metastasis-free survival, BMFS)的關系BMFS是指腫瘤患者確診后未發(fā)生骨轉移的生存時間。本組骨轉移患者的中位BMFS為13個月(10.70～15.30個月)。骨轉移患者中，PDGF-BB陽性患者的中位BMFS為11個月(8.78～13.22個月)，PDGF-BB陰性患者的中位BMFS為22個月(16.32～27.68個月)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003，圖3)。

圖3 非小細胞肺癌骨轉移組中PDGF-BB表達與患者無骨轉移生存的關系

3 討論

肺癌骨轉移嚴重影響患者的生存和生活質量，但目前肺癌骨轉移的機制尚未明確。惡性腫瘤骨轉移過程中有多種細胞(如成骨細胞、破骨細胞、骨基質細胞等)及細胞因子參與，如白介素-6、血管內皮生長因子、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factors, PDGFs)、甲狀旁腺激素相關肽等[4-6]。為探究NSCLC骨轉移過程中的關鍵因子，本課題組前期應用蛋白芯片篩選出PDGF-BB，發(fā)現(xiàn)其在骨轉移灶組織中有更高的陽性率。為進一步探究PDGF-BB與NSCLC骨轉移的關系，本實驗檢測了初診NSCLC患者血清以及NSCLC手術標本中PDGF-BB的表達，探究其在NSCLC骨轉移發(fā)生、發(fā)展及預后中的作用。

PDGF家族成員作為淋巴血管生成因子包括5個結構相關的成員PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD[7-8]。PDGF通過與血小板衍生生長因子受體(platelet derived growth factor receptor, PDGFR)-α和PDGFR-β結合，激活PDGFR通路來發(fā)揮生物學作用。PDGF-BB是唯一能同時激活PDGFR-α和PDGFR-β的配體，表明PDGF-BB有著更強的激活PDGFR通路的生物學效應[9-11]。有研究表明，PDGF-BB與腫瘤的生長、浸潤和遷移密切相關，PDGF-BB表達會使癌細胞將基質細胞和內皮細胞招募到腫瘤中，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12-13]。腫瘤的進行性生長和轉移還取決于脈管系統(tǒng)發(fā)育(即血管生成)，而PDGF-BB表達可以促進腫瘤血管的生成[14]。本組發(fā)現(xiàn)，在NSCLC患者血清中，骨轉移組和除外骨轉移的遠處轉移組PDGF-BB濃度均高于無遠處轉移組(P<0.05)，提示PDGF-BB表達與NSCLC遠處轉移及骨轉移密切相關，提示PDGF-BB可能參與了NSCLC包括骨轉移在內的血行轉移過程。

有研究表明在骨轉移過程中，TGF-β從骨基質中釋放，通過Smad2/3/4信號促進腫瘤細胞分泌PDGF-BB[15]。同時，PDGFR-β通路還可通過自分泌和旁分泌機制激活[16-17]，誘導腫瘤細胞定植到骨。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，已發(fā)生遠處轉移的NSCLC組織中PDGF-BB陽性率高于無轉移組；在轉移組中，骨轉移組PDGF-BB的陽性率高于除外骨轉移的遠處轉移組。且在骨轉移組中，PDGF-BB陽性患者的BMFS短于PDGF-BB陰性患者。上述結果提示：肺癌原發(fā)灶中PDFG-BB陽性患者發(fā)生遠處轉移尤其是骨轉移的可能性更高，且更早發(fā)生骨轉移。PDFG-BB表達對于NSCLC骨轉移的發(fā)生及發(fā)生時間具有一定的預測意義，但仍需進一步的探索PDGFR-β信號途徑在NSCLC骨轉移中的關鍵分子及相應作用機制。

此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)PDGF-BB在NSCLC組織中的表達與患者年齡、組織學分級和腫瘤大小無關，而與臨床病理分期和區(qū)域淋巴轉移有關，與Zhang等[18]研究結果一致。這可能是因為腫瘤的淋巴轉移依賴于淋巴管生成[19]，淋巴管生成因子包括血管內皮生長因子和PDGF家族，PDGF-BB可以通過激活PDGFR-β信號通路來促進新的淋巴管形成，從而為腫瘤細胞的轉移提供了直接通道[20-21]。

本實驗為單中心回顧性研究，存在一定的局限性。本實驗主要探索PDGF-BB在NSCLC骨轉移中的作用機制，研究對象包括鱗狀細胞癌和腺癌，有文獻報道鱗狀細胞癌和腺癌具有不同的轉移潛能，而本組并未發(fā)現(xiàn)PDGF-BB在腺癌和鱗狀細胞癌間的表達差異，可能是由于納入的鱗狀細胞癌病例數(shù)較少，后續(xù)可再納入更多鱗狀細胞癌病例，分別分析鱗狀細胞癌和腺癌中PDGF-BB表達與骨轉移的關系，以便確定其在哪種類型NSCLC中更有價值。

綜上所述，PDGF-BB表達與NSCLC骨轉移密切相關，對于NSCLC骨轉移的發(fā)生及BMFS具有重要的預測價值，可能是NSCLC骨轉移過程中的關鍵因子。本組將進一步研究其分子機制，為PDGF-BB成為NSCLC骨轉移的重要預測指標及治療靶點提供理論基礎。