青海省海晏縣冷季草場枯草營養(yǎng)成分近紅外漫反射光譜定量分析

于 璐,王 迅*,柴沙駝,劉書杰

(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué) 畜牧獸醫(yī)科學(xué)院/青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 青海省高原放牧家畜營養(yǎng)與生態(tài)國家重點(diǎn)實驗室，青海 西寧 810016)

天然牧草營養(yǎng)含量分析，是計算草場合理載畜量及監(jiān)測草畜平衡的基礎(chǔ)，診斷草原健康狀況的重要指標(biāo)[1]，評價草業(yè)生產(chǎn)力高低的重要依據(jù)[2]。青藏高原地區(qū)受海拔高度、氣候和放牧利用時間等影響，放牧草場包括暖季(夏秋)草場和冷季(冬春)草場兩大部分，區(qū)別于其他地區(qū)，處于枯草期或枯黃期(11月-次年4月)的放牧家畜以枯草為主要采食對象，面對如此高利用率的冷季草場，如何計算冷季枯草生物量以及冷季草場營養(yǎng)狀況，成為高原畜牧業(yè)發(fā)展的瓶頸。冷季草場地上枯草量下降的主要原因是放牧家畜的采食，同時也受到牲畜踩踏、氣候及其它生物采食等影響，使得冷季草場長期處于過牧或嚴(yán)重過牧狀態(tài)，導(dǎo)致冷季產(chǎn)草量的驟減，無法提供放牧牲畜正常生長發(fā)育所需的營養(yǎng)，造成放牧家畜“冬瘦、春亡”，牧戶承擔(dān)著巨大的經(jīng)濟(jì)損失；同時高原地區(qū)放牧家畜以反芻家畜為主，長期過牧對次年牧草的生長和發(fā)育產(chǎn)生負(fù)作用，降低草場利用率和自我恢復(fù)的能力，易擴(kuò)大草場沙化的范圍[3]。有研究表明[4-5]，以暖季測定的草場營養(yǎng)儲量推算冷季草場各營養(yǎng)儲量是有偏差的；同時溫明章等[6]發(fā)現(xiàn)，返青期的羊草產(chǎn)量與冷季枯草產(chǎn)量有一定關(guān)系。由此可見，僅以暖季草場各營養(yǎng)指標(biāo)含量推算冷季草場各營養(yǎng)指標(biāo)含量是不準(zhǔn)確的，如何高效獲取冷季草場枯草各營養(yǎng)指標(biāo)含量，成為探索高效放牧養(yǎng)殖、草原生態(tài)保護(hù)等研究的新方向。

近紅外光譜分析技術(shù)(Near infrared reflectance spectroscopy, NIRS) ，是基于有機(jī)分子中與氫連接的化學(xué)鍵的吸收程度[7]，建立相關(guān)定標(biāo)模型，實現(xiàn)對其化學(xué)成分的定量分析。Norris等[8]首次將NIRS技術(shù)引入對牧草水分、蛋白質(zhì)、脂肪等的測定研究后，此技術(shù)便被大量試驗于單種牧草、青貯飼料、糞便等營養(yǎng)成分的分析[9-12]。但枯草屬非光合作用植被(Non-photosynthetic vegetation, NPV)，葉綠素含量極低，光譜吸收以木質(zhì)素、葉黃素、葉紅素和淀粉為主，對短波紅外(Short-wave infrared,SWIR)較為敏感，其中SWIR-1和SWIR-2范圍內(nèi)散射占主導(dǎo)[13]，適用于枯草營養(yǎng)含量預(yù)測的NIRS模型鮮有研究。

本研究利用NIRS技術(shù)以及實驗室測定數(shù)據(jù)，研究樣品為高原地區(qū)冷季草場枯草，利用NIRS技術(shù)對枯草的光譜進(jìn)行處理分析，建立枯草各營養(yǎng)含量的NIRS預(yù)測模型，滿足對枯草期冷季草場營養(yǎng)含量信息的實際需求，進(jìn)而開展枯草期草地營養(yǎng)狀況、載畜能力、健康水平以及沙漠化監(jiān)測等研究。旨在探討NIRS定量分析枯草營養(yǎng)含量的可行性，建立干物質(zhì)(Dry matter, DM)、粗蛋白(Crude protein, CP)、粗灰分(Crude ash, Ash)、粗脂肪(Ether extract, EE)、中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber, ADF)、木質(zhì)素(Acid detergent lignin, ADL)、鈣(Calcium, Ca)和磷(Phosphorus, P)含量的NIRS預(yù)測模型，實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確評估冷季枯草各營養(yǎng)成分含量，補(bǔ)充枯草期營養(yǎng)價值數(shù)據(jù)的空白，計算冷季草場最適營養(yǎng)載畜量，保證放牧家畜安全過冬過春。為高原畜牧部門放牧路線的安排、冷季草場區(qū)域的劃分、入冬前售宰量的確定等提供參考，同時可作為草原沙漠化以及火災(zāi)監(jiān)測、預(yù)警和評估的有效手段。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與樣品采集

海晏縣位于青海環(huán)湖區(qū)域，100°23′～101°20′ E，36°44′～37°39′ N，海拔2 726～4 583 m，屬高原亞干旱氣候，可利用草場面積約為2416.67 km2，冷季草場1395.34 km2，畜均占有草場0.0065 km2[14]。其中冷季草場類型主要為高寒草甸類，植被種類包括紫花針茅(Stipapurpurea)、異針茅(StipaalienaKeng)、芨芨草(Achnatherumcaragana)、苔草(CarexLinn)、草地早熟禾(PoapratensisL)、高山嵩草(Kobresiapygmaea)、矮嵩草(Kobresiahumips)等[15]，所選樣地植被覆蓋度為57～95%。

野外實驗于2017年11月-2018年4月12:00-14:00間開展，每月實施1次野外數(shù)據(jù)采集，選擇無積雪天氣，挑選地勢平坦、植被類型單一的區(qū)域布設(shè)樣方，采樣點(diǎn)分布如圖1所示，設(shè)置1.0 m×1.0 m樣方共23處。運(yùn)用齊地面刈割法進(jìn)行樣品采集，挑出石子、動物糞便、毒雜草等不可食部分，在采集地點(diǎn)直接稱量，分別裝入自封袋稱重、貼標(biāo)簽，帶回實驗室內(nèi)于65 ℃烘箱內(nèi)烘干(48 h)至恒重后，稱重記錄干重，單位為g/m2，粉碎過1.0 mm篩，編號、密封、常溫、避光保存用于NIRS分析和實驗室測定。

圖1 試驗區(qū)樣點(diǎn)分布情況Fig. 1 Distribution of sample points in the test area

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗室化學(xué)成分測定 干物質(zhì)(DM)：烘干稱重法；粗灰分(Ash)：馬福爐灼燒法；粗蛋白(CP)：半微量凱氏定氮法；粗脂肪(EE)：ANKOM XT15i型全自動脂肪分析儀測定；中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和木質(zhì)素(ADL)：ANKOM 200i半自動纖維分析儀測定；鈣(Ca)：高錳酸鉀容量法；磷(P)：酸溶、釩鉬黃比色法[16]。每份樣品進(jìn)行2組平行試驗，每組3次重復(fù)，取平均值代表各營養(yǎng)指標(biāo)含量。

表1 試驗區(qū)樣點(diǎn)信息表Table 1 Information of samples in test area

1.2.2 近紅外光譜掃描 選擇FOSS公司的DS2500 近紅外光譜分析儀進(jìn)行樣品光譜掃描，儀器技術(shù)參數(shù)如表2，在ISIscan軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理與采集。按編號順序依次取枯草樣品放入圓形移動樣品槽內(nèi)，覆蓋其容積的1/3即可，每次樣品采集前均掃描背景，掃描次數(shù)設(shè)為16，計算機(jī)取均值后，輸出log(I/R)形式的數(shù)據(jù)，儲存為最終光譜。實驗室測定時樣品的狀態(tài)、顆粒大小應(yīng)與NIRS掃描時一致。為弱化裝樣產(chǎn)生的誤差，每份樣品裝樣重復(fù)3次，取其均值參與NIRS建模和分析[17]。

表2 DS2500技術(shù)參數(shù)詳情Table 2 Details of DS2500 technical parameters

1.2.3 建立近紅外模型的方法 定標(biāo)軟件選用WinISIⅢ，隨機(jī)選擇193份樣品作為定標(biāo)樣品集，1/3作為驗證樣品集[18]，光譜預(yù)處理和數(shù)學(xué)計算進(jìn)行散射校正后，利用主成分分析法進(jìn)行篩選，結(jié)合修正偏最小二乘法(Modified partial least squares, MPLS) 和馬氏距離 (Mahalanobis distance)[19]建立枯草各營養(yǎng)含量NIRS定標(biāo)模型。按照Malley等[20]選擇的定標(biāo)指標(biāo)，篩選出交叉驗證標(biāo)準(zhǔn)誤差(Standard error of cross validation, SECV)和定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)誤差(Standard error of calibration, SEC)趨于0、交叉驗證決定系數(shù)(1 minus the variance ratio,1-VR)趨于1、交叉驗證相對分析誤差(Residual predictive deviation cross validation, RPDCV)較大的模型，為最優(yōu)模型。利用驗證樣品集盲驗最優(yōu)模型的外部預(yù)測能力[21]，當(dāng) (1)>3、(2)>3時，驗證通過；當(dāng)(1)>2.5、(2)<3時，模型需要調(diào)整優(yōu)化；當(dāng) (1)<2.5、(2) <2.5時，模型不可用[22]。

RPD=SD/SEP

(1)

RPDCV=SD/SECV

(2)

注：SEP.校驗標(biāo)準(zhǔn)分析誤差；SD.標(biāo)準(zhǔn)差；RPD.外部驗證相對分析誤差。

Note: SEP. Standard error of prediction；SD. Standard deviation；RPD. Residual predictive deviation.

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草營養(yǎng)成分實驗室測定

枯草營養(yǎng)成分測定結(jié)果如表3所示，DM、Ash、CP、EE、ADF、NDF、ADL、Ca和P含量分別為95.71%～98.36%、5.40%～6.44%、3.14%～6.93%、1.87%～3.66%、40.34%～45.45%、59.57%～66.33%、10.94%～24.37%、2.96%～6.12%和0.023%～0.047%?？梢?，枯草相比于天然牧草，具有較高的ADF、NDF和ADL，CP、Ca含量較低，P含量極微少，EE含量與天然牧草相近。

2.2 近紅外掃描結(jié)果

全部樣品NIRS光譜如圖2，圖中光譜存在多個吸收峰，吸收峰高低具有較好的區(qū)分度，因此，NIRS光譜可以作為枯草營養(yǎng)成分定量測定的依據(jù)[23]。由于枯草的纖維素和木質(zhì)素含量高[24]，色素吸收光譜以葉紅素和葉黃素為主，同時自由水的損失、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，使得枯草光譜區(qū)別于綠色植被光譜，在紅、藍(lán)波段無吸收峰出現(xiàn)，而是在1 900～2 200 nm出現(xiàn)特征峰。

表3 枯草營養(yǎng)成分實驗室化學(xué)分析結(jié)果Table 3 Laboratory chemical analysis results of hay nutrients

圖2 枯草樣品可見/近紅外光譜圖Fig. 2 Near infrared reflectance spectroscopy of the hay sample

2.3 最優(yōu)定標(biāo)模型及驗證

在WinISIⅢ定標(biāo)軟件中，回歸方法選擇修正偏最小二乘法(MPLS)，結(jié)合不同光譜處理方法對定標(biāo)樣品集進(jìn)行建模，篩選出枯草各營養(yǎng)指標(biāo)最優(yōu)NIRS定標(biāo)模型，最優(yōu)模型參數(shù)如表4。表中DM、CP、NDF和ADL的SECV分別為0.2735、0.5231、1.0945和2.3858，1-VR分別為0.9014、0.9847、0.9426和0.6142，RPDCV、RPD均大于3.；Ash、EE、ADF、Ca和P的SECV分別為0.9156、0.9459、1.6154、1.0316和0.0204 ，1-VR分別為0.9346、0.6165、0.9426、0.8931和0.8622，RPD分別為3.5439、1.3291、12.4669、2.3586和0.1711，RPDCV均小于2.5。以Park等[25]的評價方式為基準(zhǔn)，DM、CP、NDF和ADL模型可以實現(xiàn)較高預(yù)測能力的近紅外定量分析；Ash、EE、ADF、Ca和P模型無法進(jìn)行近紅外的定量分析。

3 討 論

本研究主要利用NIRS技術(shù)，針對高原地區(qū)冷季草場枯草，共采集276份樣品，構(gòu)建枯草中DM、CP、Ash、EE、NDF、ADF、ADL、Ca和P的預(yù)測模型。其中DM、CP、NDF和ADL模型預(yù)測能力較好，DM模型測定能力最佳(1-VR=0.9014,RSQ=0.9512, RPDCV=6.8513)，何云等[26]在苜蓿青干草的定標(biāo)模型研究中也曾論證DM模型的預(yù)測能力； NIRS技術(shù)主要測定N-H鍵等含氫基團(tuán)[27]，與凱氏定氮法測定的為同價氮，本文CP模型具有較好的預(yù)測能力(1-VR=0.9847,RSQ=0.9362,RPDCV=5.1232)，這與惠明弟等[28]在玉米粗蛋白近紅外預(yù)測模型研究中的結(jié)果相近；ADL和NDF模型的預(yù)測能力較好(1-VR=0.6142,RSQ=0.9121,RPDCV=3.9804和1-VR=0.9873,RSQ=0.9044,RPDCV=4.3673)，這可能與枯草中自由水含量低、木質(zhì)素含量高等植物特性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)，與陳曉玲[29]建立羊草干草NDF的NIRS模型結(jié)果相近(RSQ為0.9594)。本文Ash、EE、ADF、Ca和P的NIRS模型欠佳(RPDCV、RPD<3，RSQ <0.7)，這可能由于Ca和P等微量元素中含氫基團(tuán)較少，且枯草期主要貯存于植株根部，地上植株部分含量極微少，在近紅外光譜波長范圍內(nèi)吸收較微弱，但Shenk等[30]在牧草P含量測定中，證明了NIRS技術(shù)的可行性，劉哲[31]得出天然牧草Ca與Ash的NIRS模型可以用于實際檢測，因此日后還需大量實驗研究NIR模型在枯草P、Ca、Ash含量預(yù)測中的適用性；可能由于葉綠素和脂溶性維生素等影響，NIRS技術(shù)預(yù)測枯草中EE含量偏差較大，與杜雪燕等[32]結(jié)論一致，NIRS技術(shù)能否用于預(yù)測枯草中EE含量有待考究。自從將NIRS技術(shù)引入天然牧草營養(yǎng)成分測定的研究后，構(gòu)建了許多預(yù)測能力較好的定量分析模型[33-36]，高原地區(qū)特殊的氣候與文化因素，使得進(jìn)入枯草期后的冷季草場利用率提高，放牧家畜大多以枯草為食，由于枯草擁有不同于光合作用植株的光譜特征，而具有較好預(yù)測能力、普適性較高的枯草營養(yǎng)價值近紅外模型還未曾出現(xiàn)。本文僅初步探究了針對高原地區(qū)冷季草場枯草營養(yǎng)成分的近紅外模型，為快速進(jìn)行枯草產(chǎn)量及冷季草場營養(yǎng)價值評價等研究提供新思路，為冷季載畜量計算、冷季過牧監(jiān)測、冷季火災(zāi)監(jiān)測以及草原生態(tài)評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但不同地區(qū)植被類型、氣候、土壤以及地理因素等影響，還需要更多草地研究學(xué)者的努力，對各地區(qū)冷季枯草進(jìn)行采集與處理，完善各地區(qū)枯草營養(yǎng)成分近紅外監(jiān)測模型數(shù)據(jù)庫，因地制宜的制定和指導(dǎo)冷季放牧。同時，枯草中鎂(Mg)、銅(Cu)、鋅(Zn)等其他礦物質(zhì)元素含量能否利用NIRS技術(shù)進(jìn)行預(yù)測，還需要更多學(xué)者研究分析。

表4 最優(yōu)定標(biāo)模型參數(shù)Table 4 Optimal calibration model parameters

4 結(jié) 論

研究以青海省海晏縣為試驗區(qū)，以冷季草場枯草為試驗樣品，討論NIRS技術(shù)在枯草營養(yǎng)含量預(yù)測中的可行性，數(shù)學(xué)回歸方法為修正偏最小二乘法，對比各種光譜處理方法，確定最優(yōu)NIRS預(yù)測模型?？莶軩M、CP、NDF和ADL的NIRS模型預(yù)測能力較好，可以快速評價高原地區(qū)冷季草場枯草的品質(zhì)；Ash、EE、ADF、Ca和P的NIRS模型欠佳，仍需結(jié)合實驗室測定優(yōu)化模型，是否可以進(jìn)行實際預(yù)測還需通過大量實驗，驗證其可行性。