β-連環(huán)蛋白慢病毒載體的構(gòu)建及其基因沉默MDBK細(xì)胞系的建立

杜新瑩，王洪梅，何洪彬

(1. 山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2. 山東師范大學(xué) 反芻動(dòng)物疾病研究中心， 山東 濟(jì)南 250014)

Wnt通路是調(diào)控細(xì)胞增殖分化、胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞癌變等生物過(guò)程的高度保守的信號(hào)通路[1-3]，主要分為依賴β-連環(huán)蛋白(β-catenin,β-CAT)的經(jīng)典Wnt通路、平面細(xì)胞極性非經(jīng)典Wnt通路以及Wnt-Ca+非經(jīng)典Wnt通路[4]。在經(jīng)典Wnt通路中，腺瘤樣蛋白( colorectal adenoma-like protein，APC)、軸相關(guān)蛋白( axin-related protein，Axin)、周期蛋白依賴性激酶抑制因子1(casein kinase 1,CK1)和G-聯(lián)蛋白糖原合成酶激酶3β( glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)組成的降解復(fù)合體對(duì)于該信號(hào)通路的調(diào)控發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。當(dāng)Wnt通路未激活時(shí)，β-連環(huán)蛋白降解復(fù)合體處于穩(wěn)定狀態(tài)，CK1和GSK-3β先后磷酸化β-連環(huán)蛋白特定位點(diǎn)，磷酸化的β-連環(huán)蛋白被泛素連接酶識(shí)別，隨后通過(guò)蛋白酶體降解。因此，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-連環(huán)蛋白的蛋白濃度維持在較低水平。當(dāng)Wnt通路激活時(shí)，β-連環(huán)蛋白降解復(fù)合體解聚，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-連環(huán)蛋白不斷積累，并進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)c-myc、cyclin等下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[2，6-8]。

據(jù)報(bào)道，β-連環(huán)蛋白影響人類(lèi)免疫缺陷病毒、類(lèi)豬圓環(huán)病毒、人類(lèi)巨細(xì)胞病毒、丙型肝炎病毒等多種病毒的增殖和復(fù)制[9-11]，而β-連環(huán)蛋白對(duì)牛病毒復(fù)制影響的研究較少。因此，本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建牛β-連環(huán)蛋白R(shí)NA干擾載體，篩選出有效沉默牛β-連環(huán)蛋白的shRNA載體，并建立沉默牛β-連環(huán)蛋白的MDBK細(xì)胞系，為從基因沉默水平開(kāi)展β-連環(huán)蛋白功能研究及其對(duì)牛病毒復(fù)制影響的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和載體

293T細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、大腸桿菌DH5α均由本實(shí)驗(yàn)室保存；β-連環(huán)蛋白過(guò)表達(dá)重組載體pLVX-IRES-Flag-β-catenin由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存；慢病毒包裝載體pYr-Lvsh及輔助質(zhì)粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG購(gòu)買(mǎi)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

DMEM、PBS、胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM均為Gibco公司產(chǎn)品，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)買(mǎi)自北京天根生化科技有限公司，轉(zhuǎn)染試劑Attractene○R為QIAGEN公司產(chǎn)品，細(xì)胞裂解液RIPA、5× SDS蛋白上樣緩沖液、TBE電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜液、10%PAGE凝膠試劑盒、TBST、超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒均購(gòu)買(mǎi)自上海雅酶生物科技有限公司，β-連環(huán)蛋白抗體、Flag抗體來(lái)自Santa Cruz公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中牛β-連環(huán)蛋白的基因序列(NM_001076141)，利用網(wǎng)站(https://rnaidesigner. thermofisher.com/rnaiexpress/design.do)設(shè)計(jì)3對(duì)針對(duì)牛β-連環(huán)蛋白基因的shRNA序列，另外設(shè)計(jì)1對(duì)陰性對(duì)照shRNA引物，其與牛基因組所有基因無(wú)同源性(見(jiàn)表1)。上述引物均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

表1 β-連環(huán)蛋白shRNA引物、陰性對(duì)照shRNA引物、測(cè)序引物序列Table 1 β-catenin shRNA primer, negative control shRNA primer , and sequencing primer

1.4 β-連環(huán)蛋白shRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將β-連環(huán)蛋白3對(duì)shRNA的上下游引物分別退火，根據(jù)慢病毒包裝系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)，退火體系如表2所示，退火方式為95 ℃水浴4 min，然后90 min內(nèi)自然冷卻到室溫。隨后與經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切的pYr-Lvsh載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐抗性的LB平板，37 ℃ 培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落于含有氨芐的LB試管內(nèi)，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行XhoI單酶切鑒定和U6引物測(cè)序鑒定[12-14]。

1.5 β-連環(huán)蛋白shRNA重組質(zhì)粒干擾效率驗(yàn)證

將人腎上皮細(xì)胞(293T細(xì)胞)經(jīng)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)于60 mm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Opti-MEM分別稀釋質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑Attractene○R，分別將pYr-Lvsh-β-CAT1、pYr-Lvsh-β-CAT2、pYr-Lvsh-β-CAT3、pYr-Lvsh-NC與pLVX-IRES-β-catenin-Flag共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，8 h后更換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)至48 h收獲細(xì)胞樣品進(jìn)行Western blot。

表2 β-連環(huán)蛋白shRNA引物退火的體系Table 2 The system of annealing with primers ofβ-catenin shRNA

1.6 Western blot檢測(cè)

將60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液棄掉，加入PBS清洗2遍，刮取細(xì)胞后4 ℃、3 000 r/min離心4 min，棄上清；在細(xì)胞沉淀內(nèi)加入適量細(xì)胞裂解液RIPA在冰浴條件下裂解1 h，4 ℃、10 000 r/min離心2 min，取細(xì)胞裂解上清液；在細(xì)胞裂解上清液內(nèi)按比例加入5× SDS蛋白上樣緩沖液，混勻，煮沸5 min；取20 μL煮沸的蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，將膠分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜；將PVDF膜置于孵育盒內(nèi)，加入8%脫脂奶粉室溫封閉2 h；棄去封閉液，加入含F(xiàn)lag一抗的新鮮封閉液，室溫孵育2 h；棄掉一抗，用TBST洗膜3遍，5 min/遍；加入含二抗的新鮮封閉液，室溫孵育2 h；棄掉二抗，用TBST洗膜3遍，5 min/遍；PVDF膜上滴加適量ECL顯色液，利用化學(xué)發(fā)光儀成像。

1.7 慢病毒的包裝

293T細(xì)胞培養(yǎng)于100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞融合度為70%～80% 時(shí)，將輔助質(zhì)粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG分別與pYr-Lvsh-β-CAT1、pYr-Lvsh-β-CAT2、pYr-Lvsh-β-CAT3、pYr-Lvsh-NC共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，8 h后更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，無(wú)菌收集上清液，4 ℃、3000 r/min 離心 10 min，收集上清液，其內(nèi)含有包裝好的重組慢病毒。

1.8 沉默β-連環(huán)蛋白的MDBK單克隆細(xì)胞的篩選與鑒定

將培養(yǎng)于100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)、細(xì)胞融合度為70%～80%的MDBK細(xì)胞加入包裝好的重組慢病毒和適量新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；慢病毒感染48 h后，更換含有5 μg/mL嘌呤霉素的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每3 d換液一次，直至長(zhǎng)出單細(xì)胞克隆。通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞克隆，培養(yǎng)后利用克隆環(huán)分離帶有綠色熒光的單克隆，傳代擴(kuò)大培養(yǎng)[15]，并通過(guò)Western blot檢測(cè)β-連環(huán)蛋白的沉默效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 成功構(gòu)建pYr-Lvsh-β-CAT載體

分別將3種shRNA上、下游引物進(jìn)行退火，得到干擾牛β-連環(huán)蛋白基因的shRNA。慢病毒載體pYr-Lvsh經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后與β-連環(huán)蛋白的shRNA分別進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，使用XhoI單酶切鑒定。由于pYr-Lvsh載體和shRNA內(nèi)均含有1個(gè)XhoI酶切位點(diǎn)，XhoI單酶切后產(chǎn)生2條約為6.5 kb和2 kb的條帶(圖1)。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，將測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別命名為pYr-Lvsh-β-CAT1、pYr-Lvsh-β-CAT2、pYr-Lvsh-β-CAT3，對(duì)照質(zhì)粒命名為pYr-Lvsh-NC。

2.2 沉默β-連環(huán)蛋白的干擾重組載體的篩選

將β-連環(huán)蛋白過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒pLVX-IRES-β-catenin-Flag分別與pYr-Lvsh-β-CAT1、pYr-Lvsh-β-CAT2、pYr-Lvsh-β-CAT3、pYr-Lvsh-NC共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，利用Flag抗體，通過(guò)Western blot檢測(cè)β-連環(huán)蛋白的表達(dá)情況，以篩選有效沉默β-連環(huán)蛋白的干擾載體。如圖2所示，與對(duì)照pYr-Lvsh-NC相比，pYr-Lvsh-β-CAT1/2/3均未檢測(cè)到β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，表明重組干擾載體pYr-Lvsh-β-CAT1/2/3有效地沉默了β-連環(huán)蛋白的表達(dá)。

圖1 β-CAT shRNA重組載體Xho I單酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Single-enzyme digestion identification of the β-CATshRNA recombinant vector by Xho I 1. pYr-Lvsh-NC;2. pYr-Lvsh-β-CAT1;3. pYr-Lvsh-β-CAT2;4. pYr-Lvsh-β-CAT3;M.DL10000DNA Marker

圖2 β-CAT shRNA重組載體干擾效率的驗(yàn)證Fig.2 Identification about interference efficiency of β-CAT shRNA recombinant vector 1. pYr-Lvsh-β-CAT1;2. pYr-Lvsh-β-CAT2;3. pYr-Lvsh-β-CAT3;4. pYr-Lvsh-NC

2.3 重組慢病毒的包裝

將重組慢病毒載體pYr-Lvsh-β-CAT1/2/3和pYr-Lvsh-NC 分別與輔助質(zhì)粒在293T細(xì)胞上進(jìn)行慢病毒包裝。在所構(gòu)建的重組pYr-Lvsh-β-CAT1/2/3載體中，shRNA位于hU6 啟動(dòng)子下游，載體中還有CMV啟動(dòng)子的copGFP元件。重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，GFP表達(dá)。因此，通過(guò)倒置熒光顯微鏡檢測(cè)帶有GFP熒光的細(xì)胞，結(jié)果如圖3所示，表達(dá)GFP的細(xì)胞在90%以上，表明獲得的4種重組載體均成功包裝出高效的重組慢病毒。

2.4 沉默β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選

將包裝好的重組慢病毒感染MDBK細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選出6株細(xì)胞克隆，其中pYr-Lvsh-β-CAT1的細(xì)胞克隆2株，分別命名為shβ-CAT1-1、shβ-CAT1-2；pYr-Lvsh-β-CAT2的細(xì)胞克隆2株，分別命名為shβ-CAT2-1、shβ-CAT2-2；pYr-Lvsh-β-CAT3和pYr-Lvsh-NC的細(xì)胞克隆各1株，分別命名為shβ-CAT3-1和sh NC。Western blot檢測(cè)上述6株細(xì)胞克隆β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，通過(guò)β-CAT/β-actin進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照細(xì)胞系shNC相比，shβ-CAT1-2和shβ-CAT2-2細(xì)胞系中β-連環(huán)蛋白的表達(dá)顯著降低，由此表明這2株細(xì)胞系可有效沉默β-連環(huán)蛋白。

圖3 重組慢病毒感染293T細(xì)胞的熒光檢測(cè)Fig.3 Fluorescence detection of 293T cells infected by recombinant lentivirus 1. pYr-Lvsh-β-CAT1;2. pYr-Lvsh-β-CAT2;3. pYr-Lvsh-β-CAT3;4. pYr-Lvsh-NC

圖4 β-CAT干擾細(xì)胞系的篩選與鑒定Fig.4 Screening and identification of the cell linesstably silencing with β-CAT1. sh β-CAT1-1;2. sh β-CAT1-2;3. sh β-CAT2-1;4. sh β-CAT2-2;5. sh β-CAT3-1 6. sh NC

3 討 論

近些年中國(guó)養(yǎng)牛業(yè)快速發(fā)展，集約化程度不斷提高，與此同時(shí)牛病毒性傳染病的預(yù)防和控制形勢(shì)日益嚴(yán)峻。目前可用于牛病毒性疾病的商品化疫苗較少，因而有必要進(jìn)行包括天然免疫在內(nèi)的多種途徑的綜合防控研究，以期找到新的藥物靶點(diǎn)，為抗病毒新藥的研發(fā)提供思路和線索。β-連環(huán)蛋白是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵組分，在抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可以直接或間接地調(diào)控HIV、HCMV、HCV等多種病毒的增殖復(fù)制和致病性。一方面，激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可以促進(jìn)某些病毒的增殖。研究表明，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以促進(jìn)牛皰疹病毒1型的增殖復(fù)制；使用Wnt3a激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以促進(jìn)流感病毒mRNA的表達(dá)以及流感病毒病毒粒子的產(chǎn)生。另一方面，激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可以抑制某些病毒的增殖，使用LiCl激活Wnt/β-catenin通路可以抑制HIV在外周單核細(xì)胞中的增殖；敲除β-連環(huán)蛋白基因可以有效促進(jìn)艾滋病病毒的增殖[16-18]。然而，β-連環(huán)蛋白對(duì)牛易感病毒影響的研究相對(duì)較少，尤其是β-連環(huán)蛋白是否參與牛副流感病毒的復(fù)制目前還缺乏深入的研究。

過(guò)表達(dá)和沉默是研究基因功能的主要技術(shù)手段，β-連環(huán)蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及人多種細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。通過(guò)沉默β-連環(huán)蛋白可以為研究β-連環(huán)蛋白與其他基因相互作用以及對(duì)病毒復(fù)制的影響提供一個(gè)重要途徑。本研究針對(duì)牛β-連環(huán)蛋白序列設(shè)計(jì)shRNA特異性引物并構(gòu)建重組載體，隨后包裝出的重組慢病毒感染細(xì)胞，shRNA被表達(dá)出來(lái)，在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer酶降解為siRNA，發(fā)揮RNA干擾活性。由于MDBK細(xì)胞難以轉(zhuǎn)染，因而，在本研究中利用慢病毒包裝及嘌呤霉素抗性篩選來(lái)構(gòu)建MDBK穩(wěn)定細(xì)胞系。所篩選到的shβ-CAT1-2和shβ-CAT2-2細(xì)胞系能夠有效沉默β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，經(jīng)過(guò)多次傳代仍能保持較好的沉默效果，最終篩選出高效沉默干擾β-連環(huán)蛋白的細(xì)胞系，解決了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率低、試驗(yàn)重復(fù)性差等問(wèn)題。此外，MDBK細(xì)胞對(duì)牛的多種病毒易感，牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛流行熱病毒、牛副流感病毒3型等多種病毒均可在MDBK細(xì)胞定植、增殖，是研究牛病毒與宿主相互作用的重要細(xì)胞模型。

綜上所述，本研究中β-連環(huán)蛋白沉默細(xì)胞系的建立為研究其在Wnt信號(hào)通路中的作用及其對(duì)牛病毒增殖復(fù)制的影響提供了良好的細(xì)胞模型，并為深入研究β-連環(huán)蛋白的功能和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)構(gòu)建牛β-連環(huán)蛋白特異性shRNA慢病毒載體，進(jìn)一步建立了穩(wěn)定干擾牛β-連環(huán)蛋白的MDBK細(xì)胞系，為牛β-連環(huán)蛋白與牛易感病毒的相互作用以及分子機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。