不同糖化血紅蛋白臨床檢驗方法檢測結(jié)果的相關(guān)性和一致性評價

朱秀霞 （第一作者），潘曉芳 （第一作者），吳靜標(biāo)，張潤鋒，黃宇哲，鐘乘坊 （通信作者）

1廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗所 （廣東廣州 510663）；2江西省贛州市贛縣區(qū)人民醫(yī)院（江西贛州 341100）

糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）是典型的糖基化蛋白，能夠反映受試者測定前120 d的平均血糖水平，可用于糖尿病早期診斷和病后血糖監(jiān)測［1－3］。與血糖相比，HbA1c具有生物學(xué)變異性小、不易受血糖波動影響、無需空腹或特定時間取血、分析前穩(wěn)定性高等特點。WHO糖尿病學(xué)會和許多國家的糖尿病學(xué)會均將HbA1c作為診斷糖尿病的首選指標(biāo)［3］。

《體外診斷試劑注冊管理辦法》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）第十七條規(guī)定，根據(jù)產(chǎn)品風(fēng)險程度的高低，將體外診斷試劑依次分為第三類、第二類、第一類產(chǎn)品。HbA1c檢測試劑（盒）屬于第二類產(chǎn)品中的第4小類，按二類產(chǎn)品進(jìn)行管理［4］。目前，臨床實驗室普遍采用的HbA1c檢驗方法主要有基于HbA1c與非HbA1c所帶電荷不同的離子交換層析法和電泳法，以及基于HbA1c與非HbA1c結(jié)構(gòu)不同的免疫法、親和層析法及酶法［3］。不同檢驗方法所依據(jù)的原理各不相同，所測組分亦不同，如離子交換色譜法測定的為HbA1c，親和層析法測定的為總HbA1c，國際臨床化學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗室聯(lián)盟 （International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）及“美國國家HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化計劃（National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP）” 均規(guī)定以“HbA1c”結(jié)果報告［3］。

NGSP將高效液相色譜法作為測定HbA1c的參考方法，其也是測定HbA1c的指定比對方法［5］。ARKRAY Factory，Inc.公司的高效液相色譜系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于我國大型醫(yī)院中，在國內(nèi)具有較高的市場占有率，檢測HbA1c的效果較好［6－8］?；诖?，本研究以ARKRAY Factory，Inc.檢測系統(tǒng)為對照系統(tǒng)，分析高效液相色譜法、硼酸親和色譜層析法、免疫比濁法與ARKRAY Factory，Inc.檢測系統(tǒng)測定HbA1c結(jié)果的相關(guān)性及一致性，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜法（A考核系統(tǒng)）：儀器為全自動糖化血紅蛋白分析儀（廣東優(yōu)尼德生物科技有限公司，型號：HA－120），試劑均由廣東優(yōu)尼德生物科技有限公司提供，分別為HbA1c洗脫緩沖液A試劑盒（高效液相色譜法）和HbA1c洗脫緩沖液B試劑盒（高效液相色譜法）、HbA1c溶血劑、HbA1c校準(zhǔn)品、HbA1c質(zhì)控品。

硼酸親和色譜層析法（B考核系統(tǒng)）：儀器為特定蛋白分析儀（廣東優(yōu)尼德生物科技有限公司，型號：UNT5000），試劑均由廣東優(yōu)尼德生物科技有限公司提供，分別為HbA1c檢測試劑盒 （硼酸親和色譜層析法）、HbA1c質(zhì)控品。

免疫比濁法（C考核系統(tǒng)）：儀器為全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號：邁瑞B(yǎng)S800M），試劑均由廣東優(yōu)尼德生物科技有限公司提供，分別為HbA1c測定試劑盒（酶法）、HbA1c校準(zhǔn)品、HbA1c質(zhì)控品。

ARKRAY Factory，Inc.檢測系統(tǒng)（D對照系統(tǒng)）：儀器為全自動糖化血紅蛋白分析儀（ARKRAY Factory，Inc.，型號：HA－8180），試劑均由ARKRAY Factory，Inc.提供，分別為洗脫緩沖液ELUENT 80A（高效液相色譜法）和洗脫緩沖液ELUENT 80B（高效液相色譜法）、HbA1c溶血劑、HbA1c校準(zhǔn)品、HbA1c質(zhì)控品。

1.2 樣本和方法

選取118份靜脈全血樣本（來自糖尿病患者和普通血糖測試者）作為檢測樣本，分別采用A、B、C考核系統(tǒng)和D對照系統(tǒng)單次檢測所有樣本，操作均按照對應(yīng)儀器的說明書開展，檢測前，確保儀器已經(jīng)校準(zhǔn)且室內(nèi)質(zhì)控在控，檢測后，分別計算A、B、C考核系統(tǒng)和D對照系統(tǒng)檢測的HbA1c含量。

2 檢驗原理

2.1 高效液相色譜法

依據(jù)樣本中各組分蛋白所帶電荷不同，分離HbA1c與其他蛋白組分。不帶正電荷的HbA1c首先被快速洗脫下來，帶正電荷的非糖基化血紅蛋白（non－glycated hemoglobin，HbA0）最后被洗脫下來。不同血紅蛋白組分經(jīng)比色計檢測得到對應(yīng)的吸光度值，根據(jù)Lambert－Beer定理，便可計算各成分的含量，從而計算HbA1c占總血紅蛋白的百分比。

2.2 硼酸親和色譜層析法

樣本與紅細(xì)胞裂解液反應(yīng)后，紅細(xì)胞發(fā)生裂解，藍(lán)色的硼酸鹽化合物與HbA1c的順式二醇配合物相結(jié)合形成藍(lán)色HbA1c，其余的血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色沉淀，使用分析儀分別檢測藍(lán)色（HbA1c）和紅色（血紅蛋白）的顏色強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，從而測定樣本中HbA1c占總血紅蛋白的百分比。

2.3 免疫比濁法

樣本中的HbA1c與膠乳、HbA1c特異性單克隆抗體結(jié)合形成膠乳－HbA1c－HbA1c特異性單克隆抗體的復(fù)合物，此復(fù)合物由于羊抗鼠lgG抗體而形成凝集，凝集量與膠乳表面固相化的HbA1c的量有關(guān)，樣本吸光度代入HbA1c校準(zhǔn)曲線后，可反推出樣本中HbA1c占總血紅蛋白的百分含量。

3 結(jié)果

參照《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》、《北京市第二類體外診斷試劑臨床試驗指導(dǎo)原則（2016版）》、EP9－A《Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples》等法規(guī)性文件［9－11］，對A、B、C考核系統(tǒng)和D對照系統(tǒng)測定HbA1c的結(jié)果進(jìn)行線性相關(guān)性和Bland－Altman分析。

3.1 線性相關(guān)性分析

依據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》［9］，以A與D、B與D、C與D兩兩檢測系統(tǒng)為一組研究對象，用EXCEL 2013作散點圖［11］（見圖1），由圖1可知，R2（A與D為0.9763、B與D為0.9995、C與D為0.9848）均＞0.95，表明A與D、B與D、C與D兩兩檢測系統(tǒng)間的檢測結(jié)果均具有良好的線性關(guān)系。

圖1 A與D、B與D、C與D兩兩檢測系統(tǒng)間檢測HbA1c結(jié)果的散點圖

3.2 Bland－Altam分析

以A與D、B與D、C與D兩兩檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果比值的均值為橫坐標(biāo)，比值為縱坐標(biāo)，用MedCalcv19.0.7醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析和作圖［12］，結(jié)果見表1和圖2。A與D、B與D、C與D分別只有0、4.24% （5／118）、1.69% （2／118）的點（均＜5%）在95%一致性界限以外，大多數(shù)檢測結(jié)果均在d－1.96SD～d＋1.96SD以內(nèi)。A與D、B與D、C與D 的95% 一致性界限分別為 （0.920，1.084）、（1.030，1.057）、（0.942，1.079），均在LoA的可信區(qū)間范圍內(nèi)，即對于大多數(shù)樣本，A與D、B與D、C與D的測量結(jié)果相差8.0%～8.1%、3.0% ～5.7%、5.2% ～7.9%，此差異在臨床上均可接受，因此，A與D、B與D、C與D兩兩檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果一致性良好，檢測結(jié)果可以互換。

表1 Bland－Altam分析數(shù)據(jù)

圖2 A與D、B與D、C與D檢測系統(tǒng)間HbA1c檢測結(jié)果的Bland－Altman圖

4 結(jié)論

A與D、B與D、C與D檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果具有良好的線性相關(guān)性和一致性，A、B、C考核系統(tǒng)均可代替ARKRAY Factory，Inc.分析系統(tǒng)檢測HbA1c，但因不同分析系統(tǒng)采取的檢測原理不同，干擾因素亦不同，臨床上應(yīng)根據(jù)可能存在的干擾因素，選擇合適的分析系統(tǒng)，以獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，為臨床工作提供更好的支持。