一步水熱法合成碳量子點實現(xiàn)癌細(xì)胞的熒光成像研究

劉敬 楊紫怡 閆偉華 劉鴻飛 楊學(xué)成

摘要： ?針對傳統(tǒng)熒光染料存在合成成本高、工藝復(fù)雜、毒副作用強(qiáng)等問題，本文基于一步水熱法，以間苯二酚和磷酸為原料，經(jīng)真空干燥箱中加熱，合成了具有成本低廉、生物相容性良好的納米級熒光染料碳量子點（carbon quantum dots，CQDs）。同時，對CQD的形貌、粒徑及光學(xué)特性進(jìn)行表征，并對CQD的元素、官能團(tuán)及其在不同pH環(huán)境下的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，將CQDs應(yīng)用于癌細(xì)胞的熒光成像。研究結(jié)果表明，制備得到的CQDs具有尺寸均一，分散性良好等特點;該量子點的熒光強(qiáng)度可隨pH值的變化而改變，且在一定的pH值區(qū)間內(nèi)，CQDs的熒光強(qiáng)度與pH值存在線性關(guān)系，證明該量子點可應(yīng)用于對癌細(xì)胞的檢測及熒光成像。該研究對臨床醫(yī)學(xué)中的癌細(xì)胞識別及成像領(lǐng)域具有重要意義。

關(guān)鍵詞： ?碳量子點; 癌細(xì)胞; 熒光成像

中圖分類號： R318.51; R318.08 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

近年來，熒光成像技術(shù)發(fā)展日新月異，其在輔助治療癌細(xì)胞領(lǐng)域起到關(guān)鍵作用[1]。傳統(tǒng)的熒光染料大多含有苯環(huán)化合物，由于這些熒光染料合成成本高、工藝復(fù)雜、毒副作用強(qiáng)等因素，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用，因此開發(fā)新型的熒光染料勢在必行。作為一種新型的碳納米材料，碳量子點因其水溶性好、光穩(wěn)定強(qiáng)等性能，受到人們的關(guān)注[13]。碳量子點（carbon quantum dots，CQDs）是一類由分散的類球狀碳顆粒組成的尺寸極小的納米顆粒，粒徑一般小于10 nm。2006年，Sun Y P等人[4]報道了具有獨特?zé)晒庑再|(zhì)的CQDs，世界各地的研究人員開始對CQDs進(jìn)行更深入的研究。因其具有水溶性好、光學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)等眾多優(yōu)點，被廣泛用于醫(yī)學(xué)成像及熒光檢測等領(lǐng)域[57]。Wang T Y等人[8]以半胱氨酸和半乳糖為原料，利用不同濃度的堿溶液，合成具有藍(lán)、綠和黃三種顏色碳量子點，實驗證明其具有較好的生物相容性和穩(wěn)定的光學(xué)性能;Liu S等人[9]以青草為碳原料，通過水熱合成法制備了具有良好水溶性的氮摻雜碳量子點，成功用于Cu2+的檢測;Jiang K等人[10]以鄰苯二胺、間苯二胺和對苯二胺為原料，通過水熱合成法，制備出具有紅、綠、藍(lán)三色的碳量子點，并將其應(yīng)用于細(xì)胞成像。盡管研究人員通過多種方式合成了CQDs，但由于合成工藝復(fù)雜、步驟繁瑣、產(chǎn)值較低等問題，限制了碳量子點在熒光成像中的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，如何找到一種既綠色環(huán)保，又簡便快捷的CQDs合成方法，是整個實驗中需要邁出的第一步?；诖?，本實驗通過簡單的一步水熱法，以間苯二酚和磷酸為原料，成功制備具有獨特?zé)晒庑再|(zhì)的CQDs。利用各種表征手段，分別對CQDs的形貌、元素及官能團(tuán)進(jìn)行表征，結(jié)果顯示所制備的CQDs尺寸均一、分散性良好。同時，通過熒光分光光度計對CQDs的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征，擬合出CQDs的熒光強(qiáng)度與pH值的線性回歸曲線，并以CQDs為熒光染料，成功將其應(yīng)用于對癌細(xì)胞的檢測及熒光成像。該研究在臨床醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域意義重大。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與儀器

間苯二酚（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磷酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磷酸鹽緩沖液（上海源葉生物科技有限公司），F(xiàn)BZ1002UP型標(biāo)準(zhǔn)試劑純水機(jī)（青島富勒姆集團(tuán)），Lambda 950型紫外可見分光光度計（上海普利賽斯集團(tuán)），XB 220A型電子天平（上海普利賽斯集團(tuán)），F(xiàn)S5型熒光分光光度計（英國愛丁堡儀器公司）。

1.2 CQDs的合成

將0.11 g間苯二酚和10 mL蒸餾水充分混合后，加入0.1 mL磷酸并放入反應(yīng)釜中，隨后置于真空干燥箱加熱12 h，得到橙黃色的液體，即CQDs。

1.3 CQDs的熒光特性

制備的CQDs在紫外線光下呈藍(lán)綠色，取0.4 mL樣品加入2 mL蒸餾水稀釋，獲得實驗溶液A，在A樣品中逐步加入酸（磷酸）溶液，紫外線照射下的樣品顏色逐漸變綠，反之在A樣品中逐步加入堿（稀氫氧化鈉）溶液，紫外線照射下的樣品顏色逐漸變藍(lán)。多次制備結(jié)果相同，說明該量子點樣品具有穩(wěn)定的熒光特性，并且在不同酸堿度的影響下表現(xiàn)不同。

1.4 CQDs的熒光成像

將MCF7細(xì)胞和Hela細(xì)胞分別接種在培養(yǎng)皿中，經(jīng)37 ℃下培養(yǎng)12 h。隨后將培養(yǎng)后的兩種細(xì)胞洗滌3次，并懸浮于CQDs溶液（60 μg/mL）中，經(jīng)溫育4 h并用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌后，用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞488 nm波長激發(fā)下的熒光成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 CQDs的形貌表征

CQDs的形貌表征如圖1所示。由圖1a可以看出，已成功制備出CQDs，納米點狀材料尺寸較小，且分布均勻，證明所制備的CQDs具有良好的分散性;由圖1b可以看出，通過分析TEM圖像中的100個粒子點，求得CQDs的平均橫向尺寸為3.4±0.2 nm。

由圖1c和圖1d可以看出，所獲得的CQDs是高度均勻的，其平均高度為3.19±0.85 nm，表明制備的CQDs具有少量的層狀和近球形結(jié)構(gòu)。

2.2 CQDs的粒徑及光學(xué)特性表征

CQDs的粒徑及熒光特性分析如圖2所示。由圖2a可知，CQDs整齊的排列在平面上，表明CQDs的粒子間高度相差較小;由圖2b可知，通過熒光發(fā)射光譜研究了CQDs的光學(xué)性質(zhì)，而且在不同激發(fā)波長下，通過收集220 nm和500 nm之間CQDs的熒光發(fā)射數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在220～400 nm之間，CQDs的熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長的增加而增加，此后繼續(xù)增加激發(fā)波長，熒光強(qiáng)度逐漸降低，證明CQDs的最大激發(fā)波長為400 nm;由圖2c可知，通過對CQDs懸浮液分別照射可見光（左）和365 nm紫外線（右），觀察CQDs懸浮液的顏色，發(fā)現(xiàn)在可見光下，樣本呈橘黃色，而經(jīng)紫外照射后有明顯的綠色光通路，證明合成的CQDs呈現(xiàn)綠色熒光。

2.3 CQDs的元素及其官能團(tuán)分析

CQDs的元素及其官能團(tuán)分析如圖3所示。由圖3a可以看出，在285，400和532 eV 3個主要峰值處，分別對應(yīng)著C、N和O元素的特征峰，證明合成的材料里含有C、N和O 3種元素，考慮實驗中具有尚未完全反應(yīng)的底物或者含有一定的中間產(chǎn)物，也可能是空氣中的氮元素夾雜在產(chǎn)物中的結(jié)果。

由圖3b可以看出，C 1s的XPS光譜顯示有CO、C—N和CC特征峰，證明合成的材料中C元素含有以上三種化學(xué)鍵;由圖3c可以看出，O 1s的光譜進(jìn)一步驗證了CO（530.7 eV）和C—O（532.3 eV）的存在[1113];由圖3d可以看出，利用傅里葉紅外光譜（FTIR）對合成的CQDs進(jìn)行表面官能團(tuán)分析，發(fā)現(xiàn)在3 200～3 600 cm-1和1 654 cm-1區(qū)域的峰值，分別對應(yīng)著—OH和—CO的典型振動帶[1421]。

2.4 CQDs在不同pH環(huán)境下的熒光強(qiáng)度分析

在不同激發(fā)波長下，CQDs的熒光強(qiáng)度分析如圖4所示。由圖4a可以看出，在400 nm激發(fā)下，檢測CQDs在不同pH環(huán)境中的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)在一定的pH值下，CQDs的熒光強(qiáng)度與pH值呈現(xiàn)出相應(yīng)的線性關(guān)系。隨后通過縮小pH范圍，發(fā)現(xiàn)在pH=4.5到pH=9之間，CQDs的熒光強(qiáng)度隨pH增加而增大;由圖4b可以看出，通過對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)pH值在6～7.5的范圍內(nèi)，CQDs的熒光強(qiáng)度與pH呈現(xiàn)出線性關(guān)系，計算出R2=0.99，擬合線性回歸方程為Y=346.478X-1 778.103。

正常人體的pH值是6.5～7.1，其中越靠近中間值（pH=6.8）越正常;越靠近兩邊，離不正常的情況越近。癌細(xì)胞的pH一般較低，屬于偏酸性。鑒于癌細(xì)胞偏酸的特性，且其pH值在線性范圍之內(nèi)，設(shè)想在癌細(xì)胞培養(yǎng)中摻入所合成的CQDs，實現(xiàn)對癌細(xì)胞的檢測及熒光成像。

2.5 CQDs應(yīng)用于癌細(xì)胞的熒光成像

本實驗選用MCF7細(xì)胞和Hela細(xì)胞這兩種具有代表性的癌細(xì)胞進(jìn)行CQDs的熒光成像實驗。MCF7細(xì)胞和Hela細(xì)胞中CQDs的熒光成像如圖5所示。圖5a為MCF7細(xì)胞在60 μg mL-1的CQDs溶液中培育3 h后的激光共聚焦明場圖像，圖5d為Hela細(xì)胞在60 μg mL-1的CQDs溶液中培育3 h后的激光共聚焦明場圖像。由圖5a～圖5c可以看出，在60 μg mL-1，將MCF7細(xì)胞與CQDs溶液中培育3 h后，經(jīng)400 nm的波長激發(fā)下，細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色熒光，說明CQDs己經(jīng)成功進(jìn)入到細(xì)胞中;由圖5d～圖5f可以看出，經(jīng)過相同的處理，在Hela細(xì)胞中同樣可以觀察到綠色的熒光細(xì)胞，證明所制備的CQDs成功地應(yīng)用于癌細(xì)胞檢測及熒光成像。

3 結(jié)束語

本文以間苯二酚和磷酸為原料，通過一步法合成了具有熒光特性的CQDs。利用TEM、AFM、XPS和FTIR對所合成的CQDs的形貌、價態(tài)及官能團(tuán)進(jìn)行表征，進(jìn)一步證明所合成的CQDs大小均等、尺寸均一。通過在不同pH環(huán)境下，對CQDs的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測，證明在一定的pH范圍內(nèi)，CQDs的熒光強(qiáng)度與pH呈現(xiàn)出線性關(guān)系。利用CQDs特有的熒光性質(zhì)，成功將其應(yīng)用于癌細(xì)胞的檢測及熒光成像。此外，利用該實驗中的碳量子點熒光強(qiáng)度與pH值的線性關(guān)系，進(jìn)一步制得可量化的熒光強(qiáng)度檢測pH值的方法。該實驗也可作為其他實驗的預(yù)實驗，在初步分析細(xì)胞是否癌變等領(lǐng)域提供了一種新的思路。

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