橡膠樹‘熱研7-33-97’死皮相關(guān)研究的qRT-PCR內(nèi)參基因篩選

盧亞莉 張世鑫 楊署光 田維敏 史敏晶

摘 ?要：在橡膠樹死皮以及死皮康復(fù)相關(guān)研究中，為獲得可靠的基因表達(dá)結(jié)果，篩選合適的內(nèi)參基因顯得尤為重要。本研究以‘熱研7-33-97健康樹、三級(jí)死皮樹和死皮康復(fù)樹為試驗(yàn)材料，收集其中的膠乳，采用qRT-PCR技術(shù)，結(jié)合GeNorm、NormFinder和BestKeeper三種內(nèi)參篩選軟件，綜合分析了20個(gè)候選內(nèi)參基因在不同膠乳樣品中的表達(dá)情況。結(jié)果表明：eif2、ACT7a、UBC2b在健康樹中較穩(wěn)定;UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、ACT7b在三級(jí)死皮樹中較穩(wěn)定;UBC2b、eif2和ROC3在三級(jí)死皮恢復(fù)樹中較穩(wěn)定。選擇膠乳代謝相關(guān)基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3對候選的內(nèi)參基因進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出本研究中適合的一組穩(wěn)定可靠的內(nèi)參基因是eif2和UBC2b，其中ejf2是最佳內(nèi)參基因，18S不適合作為本研究的內(nèi)參基因。

關(guān)鍵詞：橡膠樹;死皮相關(guān);內(nèi)參基因;qRT-PCR

中圖分類號(hào)：S794.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： In order to obtain reliable gene expression results for TPD-related study of rubber tree， the selection of suita-ble reference genes is very important. In the present study， using the latex from the healthy rubber tree， the third grade tapping panel dryness （TPD） tree and the TPD-recovering tree of ‘Reyan7-33-97 as the experimental materials， the expression stability of 20 candidate reference genes were evaluated by using quantitative real-time PCR （qTR-PCR） and?softwares of geNorm， NormFinder and BestKeeper. The results showed that， reference genes eif2、ACT7a and UBC2bwere the top three stable genes in the healthy tree; UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b and ACT7b?were all stable genes in the third grade TPD tree; UBC2b、eif2 and ROC3 were stable genes for the TPD-recovering?rubber tree. Based on the different stable reference genes， relative expressions of HbDXS1， HbHMGS2 and HbNIN3 genes were analyzed respectively. The results showed that eif2 and UBC2b were a couple of stable reference genes for TPD-related study; the eif2 was the most stable internal reference gene; 18S gene was not suitable as reference gene for qTR-PCR in this study.

Keywords： Hevea brasiliensis Muell. Arg.; TPD-related; reference genes; qTR-PCR

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.012

橡膠樹死皮病，即割面干涸?。╰apping panel dryness，TPD），是在橡膠樹的割線上出現(xiàn)局部或全部不排膠的癥狀，在世界各國的植膠園中普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響天然橡膠產(chǎn)量，縮短橡膠樹的經(jīng)濟(jì)壽命，給橡膠產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重危害。我國橡膠樹死皮病發(fā)生情況尤其嚴(yán)重，成為當(dāng)前天然橡膠產(chǎn)業(yè)的主要限制因子之一[1]，因此，探索死皮病的發(fā)生機(jī)理并尋求解決辦法已成為當(dāng)務(wù)之急。利用分子生物學(xué)手段，研究橡膠樹死皮病發(fā)生和康復(fù)的分子機(jī)理已成為近年來的研究熱點(diǎn)，其中，對差異表達(dá)基因的篩選則是進(jìn)行基因功能研究和進(jìn)行分子調(diào)控的基礎(chǔ)。

基因表達(dá)分析的手段眾多，單個(gè)RNA的穩(wěn)態(tài)水平可以用不依賴PCR的方法如Northern blotting[2]和原位雜交[3]等來衡量，但這些技術(shù)耗時(shí)長，RNA用量大，實(shí)驗(yàn)難度較大，并且重現(xiàn)性較差。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）的技術(shù)由于具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、精確度高、重現(xiàn)性好、通量較高、動(dòng)態(tài)范圍較寬、無需后PCR處理[4-7]等優(yōu)點(diǎn)而成為目前最受歡迎的mRNAs檢測方法。但qRT-PCR的準(zhǔn)確性受到樣品間起始RNA的質(zhì)量和數(shù)量、cDNA合成效率以及PCR擴(kuò)增效率等諸多因素的影響[8]，控制和減少誤差的一個(gè)較好的方法就是選擇合適的內(nèi)參基因。理想的內(nèi)參基因的表達(dá)水平應(yīng)該在不同的生理與環(huán)境條件下穩(wěn)定不變[9]，但已有研究表明，生物體內(nèi)并沒有真正的、完全穩(wěn)定的內(nèi)參基因。目前，在植物qRT-PCR分析中普遍使用的內(nèi)參基因有Actin、18S等，但已有研究發(fā)現(xiàn)一種植物中的某個(gè)較為理想的內(nèi)參基因并不一定適合在其他植物中使用。因此，為獲得準(zhǔn)確的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，每進(jìn)行一項(xiàng)研究實(shí)驗(yàn)，篩選出試驗(yàn)條件下特異性的內(nèi)參基因?qū)Λ@得準(zhǔn)確的基因表達(dá)結(jié)果至關(guān)重要[6， 10]。一般用于植物和動(dòng)物內(nèi)參基因分析的常用軟件是GeNorm、NormFinder和BestKeeper[11-12]，借用這些軟件，篩選研究所需的合適的內(nèi)參基因是可以實(shí)現(xiàn)的。

大量研究表明，常用的內(nèi)參基因18S rRNA、HbActin在橡膠樹中不具有普適性，不同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)最好需要單獨(dú)篩選內(nèi)參基因。目前，關(guān)于橡膠樹內(nèi)參基因的報(bào)道主要是針對乳管分化、膠乳再生、排膠、不同組織、不同激素處理等展開，橡膠樹死皮發(fā)生，尤其是死皮康復(fù)研究中，缺乏相應(yīng)的內(nèi)參基因的篩選。為準(zhǔn)確研究死皮以及康復(fù)這一過程中相關(guān)基因的表達(dá)，對該過程中的內(nèi)參基因進(jìn)行分析，篩選合適的內(nèi)參基因顯得尤為重要。本研究選取18S rRNA（簡稱18S）、ACT7a、ACT7b、ADF、ADF4、CYP2、eifAa、eifAb、eif2、eif3、UBC2a、UBC2b、UBC1、UBC3、UBC4、ROC3、PTP、RH2a、RH2b、FP共20個(gè)基因作為健康橡膠樹、死皮樹和施用死皮康復(fù)營養(yǎng)劑后的死皮恢復(fù)植株相關(guān)研究中的候選內(nèi)參基因，通過qRT-PCR技術(shù)，并借助GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對20個(gè)內(nèi)參基因在‘熱研7-33-97不同樣品中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)，以期篩選出合適的內(nèi)參基因，為橡膠樹死皮以及康復(fù)相關(guān)研究中的基因表達(dá)分析奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）無性系‘熱研7-33-97定植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南儋州兩院試驗(yàn)場。選取長勢大致相同的‘熱研7-33-97的健康割膠樹、三級(jí)死皮樹和施用死皮康復(fù)營養(yǎng)劑后的死皮恢復(fù)樹作為試驗(yàn)對象，每種類型橡膠樹至少3株重復(fù)。采用3 d一刀，1/2 S的割膠制度，按照以下方法分別采集不同的膠乳樣品：（1）健康樹距離地面1 m處連續(xù)割膠5刀，收集每一刀的膠乳，分別編號(hào)為0（CK）、1、2、3、4刀;（2）三級(jí)死皮樹在正常割膠的情況下，針刺收集不排膠部位、點(diǎn)狀排膠部位、連續(xù)排膠部位水囊皮中的膠乳;移液器收集點(diǎn)狀排膠部位和連續(xù)排膠部位割線上的膠乳;（3）死皮后經(jīng)施用康復(fù)營養(yǎng)劑恢復(fù)的橡膠樹，距離地面1 m處連續(xù)割膠5刀，收集每一刀的膠乳，分別編號(hào)為0（CK）、1、2、3、4刀。收集的膠乳直接加入到裂解液SL中，混勻后，冰上保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后立即提取總RNA，于–80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?方法

1.2.1 ?膠乳總RNA提取與cDNA合成 ?橡膠樹的膠乳總RNA的提取根據(jù)RNAprep Pure Plant Kit多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）操作說明進(jìn)行。通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測提取的總RNA的完整度和純度。按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.，USA）試劑盒說明進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，合成產(chǎn)物于–20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?內(nèi)參基因的表達(dá)分析 ?根據(jù)已報(bào)道的橡膠樹內(nèi)參基因，選擇CYP2、18S、ROC3、FP、PTP、ACT7a、ACT7b、ADF、ADF4、RH2a、RH2b、eifAa、eifAb、eif2、eif3、UBC1、UBC2a、UBC2b、UBC3和UBC4共20個(gè)基因作為候選的內(nèi)參基因，采用Real-time PCR方法，分析這些基因在不同健康狀況下橡膠樹的不同部位和不同刀次收集膠乳中的表達(dá)情況。所選內(nèi)參基因的PCR引物來源于本研究團(tuán)隊(duì)。

1.2.3 基因qRT-PCR分析 ?以cDNA為模板，分別對候選內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，反應(yīng)平臺(tái)為CFX384 Real-Time PCR Detection （Bio-rad， USA）。反應(yīng)體系為10 L體系，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)使用的試劑為2x Transstart Tip Green qPCR Super Mix。每個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。利用Bio-rad CFX manager 3.0軟件，采用2–ΔΔCT算法分析基因的相對表達(dá)量。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Gern Norm和Norm Finder軟件對內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行分析;Original 8.0軟件繪制內(nèi)參基因穩(wěn)定性圖;SPSS 19.0以及Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;AI軟件進(jìn)行圖形組合。以篩選出來的內(nèi)參基因?yàn)閰⒄眨瑢λx的目的基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，驗(yàn)證內(nèi)參基因的有效性。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?巴西橡膠樹膠乳總RNA質(zhì)量檢測

在qRT-PCR基因表達(dá)分析中，總RNA的質(zhì)量直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。提取的膠乳總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，28S rRNA和18S rRNA條帶清晰完整（圖1），無降解現(xiàn)象，亮度比值約為2∶1。NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific Inc.， USA）測定OD260/OD280比值在1.8～2.1之間，出現(xiàn)單個(gè)峰值，表明RNA完整性好，純度較高，可用于后續(xù)研究。

2.2 ?內(nèi)參基因Ct值分析

基因的Ct值大小與其表達(dá)量成反相關(guān)，Ct值越小，表達(dá)量越高，反之亦然[13]。對20個(gè)候選內(nèi)參基因在不同膠乳樣品中得到的Ct值進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的Ct值在8～32之間，范圍較廣，表明不同基因表達(dá)的豐度存在較大的差異。其中18S的Ct值最小，表明其基因的表達(dá)量最高;CYP2的Ct值最高，表明其表達(dá)量最低;其余基因的Ct值介于15～25之間，分布較集中，表達(dá)豐度居中（圖2）。

2.3 ?候選內(nèi)參基因在不同樣品中表達(dá)穩(wěn)定性分析與評價(jià)

2.3.1 ?GeNorm分析 ?利用GeNorm軟件對候選內(nèi)參基因的相對表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過計(jì)算基因的表達(dá)穩(wěn)定值（M）評價(jià)基因的表達(dá)穩(wěn)定性，基因的M值越小，表達(dá)越穩(wěn)定[14]。根據(jù)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性從低到高進(jìn)行排序作折線圖，除混合的膠乳樣品外，其他樣品中大部分基因的M值低于0.5，有較好的穩(wěn)定性（圖3）。

在健康樹膠乳樣品中，穩(wěn)定性由高到低排名前10的基因分別是eif2、RH2b、UBC2a、UBC3、eifAb、PTP、ADF4、eifAa、FP和UBC2b，并且其M值差異不大，均低于0.5。其中eif2、RH2b和UBC2a最穩(wěn)定，M值約為0.4。最不穩(wěn)定的3個(gè)內(nèi)參基因?yàn)?8S、CYP2、ROC3，M值高于0.75（圖3A）。

在三級(jí)死皮樹不同膠乳樣品中，穩(wěn)定性由高到低排名前10的基因分別是UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、UBC1、ACT7b，且M值差異不明顯，均低于0.4，都可以作為合適的內(nèi)參基因。其中，UBC3、eifAb和eifAa最穩(wěn)定，M值約為0.2。最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)?8S，M值高于1.0;其次為CYP2、eif3，但M值也在0.5以內(nèi)（圖3B）。

在死皮康復(fù)樹膠乳樣品中，穩(wěn)定性由高到低排名前10位的基因分別是UBC2b、eif2、ROC3、ADF4、PTP、UBC4、RH2b、UBC1、ACT7b、eifAb，且M值均低于0.5。其中，UBC2b、eif2和 ROC3最穩(wěn)定，M值約為0.4。最不穩(wěn)定的3個(gè)內(nèi)參基因?yàn)镽H2a、CYP2、eifAa，M值均高于0.6（圖3C）。

在所有膠乳混合的樣品中，有4個(gè)基因的M值大于1.5，其他基因的M值也在1.0偏上，總體來看，表達(dá)穩(wěn)定性略差。穩(wěn)定性排名前10的基因分別是eif2、UBC3、UBC4、UBC2a、eifAb、ACT7a、UBC2b、ACT7b、UBC1、ADF。其中，eif2、UBC3和UBC4最穩(wěn)定，M值約為0.9。最不穩(wěn)定的3個(gè)內(nèi)參基因?yàn)镃YP2、FP和 PTP，M值高達(dá)2.5以上（圖3D）。之所以在這個(gè)組合中M值比較大，可能與膠乳樣品是來自狀態(tài)完全不同、差異明顯的膠乳樣品混合有關(guān)。

綜上所述，根據(jù)M值的高低，在全部樣品中均有良好穩(wěn)定性的5個(gè)內(nèi)參基因有eif2、UBC2b、RH2b、UBC3、UBC4，穩(wěn)定性一直都較差的有18S和CYP2兩個(gè)基因。

GeNorm軟件還可以通過成對的變異值（Vn/Vn+1）來確定標(biāo)準(zhǔn)化所需的參考基因的最佳數(shù)量[8]，閾值上限是0.15，以確定所需內(nèi)參的最佳數(shù)目。在此研究中，成對的變異值在0.15左右（圖3E），利用GeNorm軟件對配對組合（Vn/Vn+1）分析發(fā)現(xiàn)，在橡膠樹的不同膠乳樣品中選出2個(gè)內(nèi)參基因就可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，這與之前一些物種的研究相似[15-16]。

2.3.2 ?NormFinder分析 ?采用NormFinder軟件分析穩(wěn)定值（SV），其數(shù)值大小與穩(wěn)定值呈負(fù)相關(guān)[17]，即數(shù)值越小穩(wěn)定性越高，進(jìn)一步驗(yàn)證geNorm分析的結(jié)果。

結(jié)果表明，在健康樹膠乳樣品中，穩(wěn)定性由高到低排名前10的基因分別是eif2、ACT7a、UBC2a、ADF4、RH2b、UBC3、UBC4、PTP、eifAb、UBC2b（圖4A），其中有8個(gè)基因與geNorm評價(jià)的前10位基因相同;在三級(jí)死皮樹膠乳樣品中，排名前10位的基因分別是eifAb、eifAa、UBC2b、UBC3、RH2b、UBC4、ADF4、FP、ACT7a、eif2（圖4B），其中也有9個(gè)基因與geNorm評價(jià)的前10位基因相同;在死皮康復(fù)膠乳樣品中，排名前10位的基因分別是UBC2b、eif2、ROC3、ADF4、UBC4、PTP、RH2b、UBC1、ACT7b、eifAb，與geNorm評價(jià)的前10位基因排序一致（圖4C）;在所有膠乳的混合樣品中，排名前10位的基因分別是UBC4、eif2、UBC2a、UBC3、UBC2b、ACT7b、ACT7a、eifAb、UBC1、ADF，與geNorm評價(jià)的前10位基因相同（圖4D）。綜合來看，NormFinder和geNorm分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，得出eif2、UBC2b、UBC3、UBC4、RH2b穩(wěn)定性好，而18S和CYP2表達(dá)穩(wěn)定性較差的結(jié)果是一致的。

2.3.3 ?BestKeeper分析 ?BestKeeper軟件可用于對候選內(nèi)參基因在各樣品中的平均Ct值進(jìn)行分析[18]。一般穩(wěn)定的內(nèi)參基因在BestKeeper中具有較高的決定系數(shù)（coefficient of determination， R2）。由結(jié)果可知（表1），健康橡膠樹膠乳的穩(wěn)定性排名前10的基因依次是ACT7a、UBC2b、PTP、UBC3、eif2、FP、RH2b、RH2a、UBC2a、eifAb;三級(jí)死皮樹膠乳則是RH2b、UBC2b、FP、UBC1、eifAa、ACT7a、eif2、UBC3、ACT7b、eifAb;死皮康復(fù)橡膠樹膠乳則是FP、ROC3、UBC2b、eifAb、ADF、18S、eif2、RH2a、ACT7a、RH2b;在混合膠乳中則是：eif2、eifAa、ADF、ADF4、UBC3、eifAb、UBC2a、ACT7a、eif3、UBC4。

GeNorm、NormFinder和BestKeeper三個(gè)軟件的評估結(jié)果既有一致性，也有差異性。GeNormh和NormFinder的分析結(jié)果高度一致，而與BestKeeper的一致性略差。綜合3種結(jié)果，eif2和UBC2b兩個(gè)基因的穩(wěn)定性表現(xiàn)最好，是合適的內(nèi)參基因選擇。

2.4 ?內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證

根據(jù)軟件分析結(jié)果，選擇各樣品中3個(gè)較穩(wěn)定的基因和穩(wěn)定性較差的18S基因，分別對HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3共3個(gè)膠乳代謝相關(guān)基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，健康樹不同割膠刀次之間，HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3三個(gè)基因在以eif2、UBC2b、UBC2a為內(nèi)參時(shí)的表達(dá)規(guī)律基本一致，而以18S為內(nèi)參時(shí)則基本表現(xiàn)出相反的變化趨勢（圖5A）。

三級(jí)死皮樹不同死皮程度部位采集的膠乳樣品中，分別以穩(wěn)定的UBC3、eifAb和UBC2b為內(nèi)參分析時(shí)，HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3三個(gè)目的基因的表達(dá)變化規(guī)律基本一致，并且相對健康樹而言，表達(dá)量整體水平上降低。以18S為內(nèi)參進(jìn)行分析時(shí)，3個(gè)目的基因的表達(dá)規(guī)律明顯不同于以3個(gè)穩(wěn)定性好的內(nèi)參基因?yàn)閰⒄盏慕Y(jié)果，甚至出現(xiàn)近似于相反的表達(dá)規(guī)律（圖5B）。

死皮康復(fù)樹中，分別以穩(wěn)定性好的eif2、UBC2b和ROC3為內(nèi)參基因分析時(shí)，HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3基因的表達(dá)規(guī)律基本一致，其中尤以eif2和UBC2b為內(nèi)參時(shí)表達(dá)規(guī)律一致性更好;當(dāng)以18S為內(nèi)參進(jìn)行分析時(shí)，基因的表達(dá)量和表達(dá)規(guī)律都與前3個(gè)內(nèi)參有較大的區(qū)別（圖5C）。

3 ?討論

為獲取準(zhǔn)確的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，內(nèi)參基因的選擇顯得尤為重要。合適的、穩(wěn)定的內(nèi)參基因才能客觀、真實(shí)地反映目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。已有研究表明，內(nèi)參基因不具有通用性。不同的物種、不同的組織、不同的發(fā)育階段，甚至不同的處理?xiàng)l件下都可能需要不同的內(nèi)參基因，不經(jīng)篩選而直接選用常見的內(nèi)參基因可能使分析結(jié)果的精確性降低甚至導(dǎo)致得出錯(cuò)誤的結(jié)論。目前，篩選內(nèi)參基因常用的方法主要有Genorm、NormFinder、BestKeeper[8，17-18]。Manoli等[19]利用這些方法研究了玉米在不同實(shí)驗(yàn)條件下、不同組織中12個(gè)內(nèi)參基因的差異，篩選得到在玉米中肌動(dòng)蛋白（ACT）的穩(wěn)定性較好，而18S的穩(wěn)定性差。早期在橡膠樹qRT-PCR分析中常采用18S作為內(nèi)參基因，后來該基因也被發(fā)現(xiàn)并不適合作為橡膠樹所有的基因研究中的內(nèi)參。Li等[4]認(rèn)為在橡膠樹不同組織中RH2b和UBC2b穩(wěn)定性較好，在割膠處理中eifAb穩(wěn)定性較好。何斌[20]對20個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行分析，認(rèn)為適合膠乳再生研究的內(nèi)參基因是UBC4、ADF、UBC2a、eif2、ADF4。Long等[21]在連續(xù)割膠實(shí)驗(yàn)中評估了22個(gè)候選基因，認(rèn)為穩(wěn)定性好的前5個(gè)參考基因分別為UBC2a、UBC2b、UBC4、UBC3和ADF。Chao等[22]針對不同排膠時(shí)間篩選出合適的膠乳內(nèi)參基因是UBC2a和UBC2b。最近，吳紹華等[23]研究TSA誘導(dǎo)乳管分化過程中篩選的最佳內(nèi)參基因是UBC3。由此可見，橡膠樹有關(guān)分子機(jī)理的研究中，也沒有一個(gè)普適的內(nèi)參基因。針對不同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，有必要篩選相應(yīng)的最適內(nèi)參基因。死皮相關(guān)尤其是包含死皮康復(fù)樹方面的qRT-PCR內(nèi)參基因篩選的研究尚未見報(bào)道，為研究死皮發(fā)生以及死皮康復(fù)的分子機(jī)理，尋找合適的內(nèi)參基因顯得尤為重要。

本研究是針對橡膠樹死皮相關(guān)研究展開的內(nèi)參基因篩選，通過3個(gè)計(jì)算軟件比較了20個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)合基因穩(wěn)定性驗(yàn)證，綜合分析認(rèn)為eif2、ACT7a、UBC2b在健康樹中是最為穩(wěn)定的3個(gè)內(nèi)參基因;UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、ACT7b在三級(jí)死皮樹不同部位中都表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性;ROC3、eif2和UBC2b在三級(jí)死皮恢復(fù)樹中是較穩(wěn)定的基因?？梢姡?種類型的橡膠樹中都有良好的穩(wěn)定性表現(xiàn)的內(nèi)參基因是eif2和UBC2b，尤其其中的eif2一直都有良好的穩(wěn)定性，即使在所有膠乳混合這樣的來源差異比較大的樣品中也是最穩(wěn)定的。因此，在死皮相關(guān)研究中，認(rèn)為eif2和UBC2b是最佳的一組內(nèi)參基因，而其中的ejf2是最佳的內(nèi)參基因。18S表達(dá)豐度在20個(gè)候選基因中最高，但穩(wěn)定性最差，基因驗(yàn)證也表明不適合作為死皮相關(guān)研究的內(nèi)參基因。

本研究中利用了Genorm、NormFinder、BestKeeper三種方法來分析候選基因的穩(wěn)定性，但其中Genorm和NormFinder的分析結(jié)果一致性更高，與最終分析的結(jié)果更吻合，是較適合用來篩選內(nèi)參基因的軟件。

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