VEGF及HIF-1α在小兒鼻咽部橫紋肌肉瘤中的表達(dá)及臨床意義

李 穎 姜 嵐 張 可 任紅波 僧東杰 陶 菁

小兒橫紋肌肉瘤是多見的兒童惡性軟組織肉瘤，可發(fā)生于頭顱、四肢、軀干、泌尿生殖系等多部位，以腫物為主，因發(fā)病部位不同產(chǎn)生的壓迫癥狀和鄰近器官的侵犯癥狀而有所不同[1-2]。臨床數(shù)據(jù)顯示頭頸部為多發(fā)部位，占到45%左右[3]。該疾病瘤體生長迅速，早期發(fā)現(xiàn)診斷困難、就診時多處于臨床Ⅱ期以上、瘤體復(fù)發(fā)率高等[4]。據(jù)報道近年來小兒橫紋肌肉瘤發(fā)病率呈逐年上升趨勢，盡管目前化療、放療與手術(shù)措施不斷完善，使得患兒的生存率有了顯著提高，但其預(yù)后受到病理類型和分期等多種因素影響，仍不甚滿意，是臨床研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)問題[4-6]。本研究注意收集院內(nèi)相關(guān)病例資料，觀察血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)在小兒鼻咽部橫紋肌肉瘤中的表達(dá)及臨床意義，以期為診治工作提供參考依據(jù)，總結(jié)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2017年4月至2018年3月診治并且病理學(xué)確診的小兒鼻咽部橫紋肌肉瘤31例作為研究對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡1～12歲；②臨床資料及病理學(xué)結(jié)果完整；③家長知情同意研究內(nèi)容并配合完成隨訪工作。排除標(biāo)準(zhǔn)：①呼吸系統(tǒng)嚴(yán)重疾病患兒；②其他惡性腫瘤患兒；③其他疾病累及鼻咽部的患兒。本研究內(nèi)容符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。患兒年齡1歲9個月～11歲5個月，平均(5.9±1.6)歲；病理類型：胚胎型25例，腺泡型6例；中低分化20 例；高分化11例；I、Ⅱ期 17例，Ⅲ、Ⅳ期14例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 15 例。

1.2 方法

所有患兒的組織標(biāo)本均采用免疫組化法檢測VEGF及HIF-1α表達(dá)情況，取材后石蠟包埋進(jìn)行4 μm 連續(xù)切片，置于載玻片后75 ℃烤片，切片脫蠟，經(jīng)3%過氧化物內(nèi)源性過氧化酶消除、免疫組化抗原修復(fù)緩沖液修復(fù)，室溫下加入山羊血清封閉，加入一抗4 ℃過夜、磷酸緩沖液沖洗、加入二抗溫育30 min，沖洗后二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色，蘇木精對比染色，封片，采用雙盲法讓兩位5年以上工作經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師進(jìn)行顯微鏡下觀察，Hela細(xì)胞陽性對照，磷酸鹽緩沖液替代一抗陰性對照。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

每張切片均在400倍鏡顯微精視野下隨機(jī)選取5個視野，染色強(qiáng)度方面無著色0分、弱著色(淡黃色)1分、中等著色(棕黃色)2分、強(qiáng)著色(黃褐色)3分，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，陽性細(xì)胞百分率≤5% 0分、6%～25% 1分、26%～50% 2分、>50% 3分，染色強(qiáng)度和細(xì)胞計數(shù)分?jǐn)?shù)相加后進(jìn)行免疫組化結(jié)果判定，0分(-)、1～2分為(+)，3～4分為(++)，5～6分為(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料以[n(%)]表示、進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，VEGF及HIF-1α的表達(dá)相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，以P<0.05作為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF及HIF-1α表達(dá)陽性率分析

31例小兒鼻咽部橫紋肌肉瘤中，VEGF表達(dá)陽性率為71.0%(22/31)、HIF-1α表達(dá)陽性率為67.7%(21/31)，VEGF及HIF-1α表達(dá)陽性具有較高的一致性，見表1。

表1 本組患兒VEGF及HIF-1α表達(dá)陽性率比較(例，%)

2.2 VEGF及HIF-1α在不同臨床病理特征的患兒中表達(dá)情況分析

VEGF表達(dá)陽性與表達(dá)陰性的患兒病理類型、分化程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體數(shù)據(jù)見表2；HIF-1α表達(dá)陽性與表達(dá)陰性的患兒病理類型、分化程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體數(shù)據(jù)見表3。

表2 VEGF在不同臨床病理特征的患兒中表達(dá)情況分析(例，%)

表3 HIF-1α在不同臨床病理特征的患兒中表達(dá)情況分析(例，%)

2.3 相關(guān)性分析

31例小兒鼻咽部橫紋肌肉瘤標(biāo)本中，VEGF及HIF-1α表達(dá)結(jié)果對比具體數(shù)據(jù)見表4，VEGF及HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)(γ=0.693，P<0.05)。

表4 本組患兒組織標(biāo)本的VEGF及HIF-1α表達(dá)對比/例

2.4 隨訪生存率分析

VEGF及HIF-1α表達(dá)陽性的患兒1、2年隨訪生存率均略低于表達(dá)陰性組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具體數(shù)據(jù)見表5。

表5 VEGF及HIF-1α表達(dá)陽性的患兒生存率分析(例，%)

3 討論

小兒橫紋肌肉瘤起源于原始間葉組織，鼻咽部腫瘤可引起聲音改變、氣道梗阻、窒息和鼻出血，鼻旁竇腫瘤有疼痛、鼻腔分泌物增多、鼻出血癥狀，如有擴(kuò)散轉(zhuǎn)移可出現(xiàn)發(fā)熱、厭食、體重下降、疼痛和衰弱等情況，因癥狀缺乏特異性，易造成誤診誤治，需借助臨床病理學(xué)、免疫組織化學(xué)等方法診斷[7-8]。

橫紋肌肉瘤根據(jù)組織學(xué)和遺傳學(xué)特點(diǎn)可分為胚胎型、腺泡型、成人多形型，小兒橫紋肌肉瘤以胚胎型居多，本研究中小兒鼻咽部橫紋肌肉瘤病理確診胚胎型25例，腺泡型6例。中低分化20 例，高分化11例，有研究表明根據(jù)分化程度進(jìn)行分層和綜合治療，可以不斷優(yōu)化化療方案，進(jìn)一步改善預(yù)后，提高療效[9]。臨床分期反映腫瘤局部浸潤程度和轉(zhuǎn)移情況，有利于治療方案的選擇和預(yù)后的判斷，Ⅰ、Ⅱ期腫瘤局限，肉眼觀完全切除，Ⅲ期腫瘤未完全切除或僅活檢取樣，肉眼有殘留腫瘤，Ⅳ期診斷時已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，研究中I、Ⅱ期 17例，Ⅲ、Ⅳ期14例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者 16例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 15 例，橫紋肌肉瘤因無完整薄膜容易通過血流、淋巴管轉(zhuǎn)移，可以發(fā)生局部、區(qū)域及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，有研究表明該疾病總體生存率偏低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在關(guān)聯(lián)[10-11]。

研究結(jié)果顯示本組小兒鼻咽部橫紋肌肉瘤中VEGF、HIF-1α表達(dá)陽性率分別為71.0%、67.7%，并且表達(dá)陽性與表達(dá)陰性的患兒的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這與之前童剛領(lǐng)等[12]提出的“小兒鼻咽部橫紋肌肉瘤組織中存在HIF-1a蛋白和VEGF蛋白的高表達(dá),且與腫瘤分期有關(guān)”相一致。VEGF是1種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生、促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等[13-14]。有研究證實(shí)HIF-1a是機(jī)體應(yīng)答缺氧應(yīng)激的關(guān)鍵因子，能夠與上下游多種蛋白組成不同的信號通路，介導(dǎo)低氧信號，調(diào)控細(xì)胞產(chǎn)生一系列對缺氧的代償反應(yīng)，其可引起多種基因轉(zhuǎn)錄，使腫瘤細(xì)胞耐受低氧環(huán)境，是腫瘤細(xì)胞生長過程中重要的調(diào)控因子[15-17]。以上內(nèi)容提示VEGF、HIF-1α在腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)情況與腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、新生血管生成等密切相關(guān)，因此VEGF、HIF-1α不同表達(dá)情況的小兒鼻咽部橫紋肌肉瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著差異。

研究結(jié)果還提示小兒鼻咽部橫紋肌肉瘤組織中VEGF及HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)，考慮是在低氧環(huán)境下HIF-1α這一缺氧誘導(dǎo)因子水平升高，HIF-1α在多種腫瘤VEGF信號通路中起著樞紐作用，能夠增加VEGF轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)腫瘤新生血管形成、浸潤、轉(zhuǎn)移[18]。低氧環(huán)境下VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞膜上VEGF受體結(jié)合，自身磷酸化激活有絲分裂原活化蛋白激酶，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生，并且低氧促使VEGF提高血漿酶原活化因子活性，促進(jìn)細(xì)胞外蛋白水解[19]?？梢娦罕茄什繖M紋肌肉瘤組織中VEGF及HIF-1α的表達(dá)具有高度一致性，在腫瘤細(xì)胞發(fā)生和轉(zhuǎn)移中共同發(fā)揮作用，密切相關(guān)。

本組患兒均維持了較好的隨訪工作， 根據(jù)隨訪數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)VEGF及HIF-1α表達(dá)陽性的患兒1、2年隨訪生存率均略低于表達(dá)陰性組，這與以往的報道結(jié)果并不一致，如童剛領(lǐng)[20]曾提示VEGF及HIF-1α表達(dá)陽性的患兒3年總生存率和無疾病進(jìn)展生存率均顯著低于陽性組。VEGF及HIF-1α表達(dá)與腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、新生血管生成等密切相關(guān)，說明其表達(dá)陽性率一定程度上反映疾病的進(jìn)展情況，提示疾病嚴(yán)重程度、預(yù)測治療預(yù)后，但是本研究數(shù)據(jù)并未體現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)意義，考慮與研究樣本少、個體差異或跟蹤隨訪時間僅有2年有關(guān)，有待積累病例資料深入研究VEGF及HIF-1α表達(dá)對于預(yù)后的預(yù)測作用。

綜上所述可見，小兒鼻咽部橫紋肌肉瘤中VEGF及HIF-1α表達(dá)陽性率均較高，與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且VEGF及HIF-1α兩者的表達(dá)呈正相關(guān)，具有較高的一致性，對小兒鼻咽部橫紋肌肉瘤患兒的診治、預(yù)后判斷有一定的臨床意義。