HIF-1α、MITF、CRP、NLR在乙型肝炎病毒感染相關(guān)性肝癌中的表達(dá)及其意義

張小芳 劉志良 蔡 勇 黃傳生 羅慶豐

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發(fā)性肝癌的90%以上，而我國是乙肝大國，多數(shù)肝癌患者合并乙型肝炎病毒。HIF-1α體內(nèi)分布廣泛，經(jīng)證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，且已經(jīng)成為腫瘤研究和治療的靶點(diǎn)[1]。中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(neutrophil to lymphocyte ratio，NLR)作為炎癥因子的典型代表，是許多惡性腫瘤的研究熱點(diǎn)[2]，它們與HBV感染相關(guān)性肝癌是否有關(guān)，目前研究少有報(bào)道。本文通過比較MITF、HIF-1α、CRP及NLR在HBV感染與非感染相關(guān)性肝癌中水平差異，初步探討HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)病機(jī)制并尋找其治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集我院2016年9月至2018年3月我院初診初治的原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌患者97例，平均年齡61歲，男性60例、女性37例，根據(jù)是否感染HPV分為感染組62例、未感染組35例。所有石蠟包埋組織標(biāo)本均于常溫下10%中性緩沖福爾馬林溶液4～5倍于標(biāo)本體積中固定12～24 h。患者均為初治，術(shù)前均未接受過放療或化療等治療。所有術(shù)后標(biāo)本經(jīng)規(guī)范取材后，切片均經(jīng)由兩位高年資經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師按照2015年版《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南》明確診斷，并按Edmondson分級(jí)系統(tǒng)按高、中、低分化并完成免疫組化的判讀。同時(shí)收集患者相關(guān)臨床病理信息。

1.2 HIF-1α及MITF檢測(cè)

收集我院收治的肝癌患者97例手術(shù)標(biāo)本，每隔1 cm連續(xù)切開；常溫下10%中性緩沖福爾馬林溶液4～5倍于標(biāo)本體積，固定12～24 h，按“7點(diǎn)”基線取材方案取材。 采用Envsion二步法，同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照組并將以上組織包埋、切片、脫水，3%過氧化氫室溫孵育10 min，蒸餾水沖洗3次共9 min，高壓鍋抗原修復(fù)，滴加一抗HIF-1α多克隆抗體(美國)/MITF多克隆抗體(中杉)，37 ℃孵育4 h，PBS沖洗3次，滴加二抗工作液(均為福建邁新)，37 ℃孵育30 min，PBS在組織邊緣反復(fù)沖洗3次，DBA染色15 min，沖洗，復(fù)染，脫水，透明，人工封片后鏡下觀察。

1.3 HIF-1及MITF結(jié)果判定

HIF-1α信號(hào)以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃微細(xì)顆粒視為陽性，MITF信號(hào)以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃微細(xì)顆粒視為陽性。根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽性比例和著色強(qiáng)度綜合制定免疫組化半定量標(biāo)準(zhǔn)陽性細(xì)胞記分：每例均隨機(jī)觀察3個(gè)高倍鏡視野，取平均值。用半定量積分法判斷結(jié)果，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞≤ 5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，陽性細(xì)胞> 75%為4分；陽性強(qiáng)度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者積分相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判讀由2位病理學(xué)專家獨(dú)立評(píng)判，最后達(dá)成共識(shí)。

1.4 C反應(yīng)蛋白的檢測(cè)方法

采集所有患者不抗凝的空腹肘部靜脈血各3 ml，靜置2 h，經(jīng)3 000 r/min，離心20 min分離血清(離心半徑16 cm)，取血清置于Eppendorf管內(nèi)冷凍存于-20 ℃保存待檢。實(shí)驗(yàn)步驟、結(jié)果判斷及質(zhì)量控制方法按廠家說明。CRP≥8.2 mg/l判為陽性，測(cè)定線性范圍為(0.3～150.0)mg/l。

1.5 NLR的檢測(cè)

于術(shù)前1天，清晨采集患者的空腹靜脈血行血常規(guī)檢查，并將血常規(guī)中的中性粒細(xì)胞數(shù)值除以淋巴細(xì)胞數(shù)值計(jì)算得到NLR的比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MITF在HCC中的表達(dá)

通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)MITF在肝細(xì)胞性肝癌組織中無表達(dá)。

2.2 HIF-1α、CRP在HCC中的表達(dá)

HIF-1α在HBV感染組中高表達(dá)且高于無HBV感染相關(guān)組(卡方值為11.37，P<0.05)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CRP值在2組中高表達(dá)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 HBV感染組和未感染組HIF-1α、CRP表達(dá)情況(例，%)

2.3 NLR在HPV感染組和未感染組中的比較

NLR在HBV感染組中為3.03±1.84，在HBV未感染組中為2.42±1.83，2組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.073，P>0.05)。

3 討論

我國是肝癌大國，其中病因與患者感染乙肝病毒多年相關(guān)，因此本文選擇以HBV感染相關(guān)的HCC為觀察對(duì)象進(jìn)行研究，可能更符合我國國情及實(shí)際的臨床工作。目前，肝癌的治療主要是以手術(shù)為主，而中晚期特別是合并HBV感染的患者，因多合并肝硬化且肝功能不佳，多不能耐受手術(shù)，故治療效果不佳，死亡率高。因此積極探討肝癌的可能致病機(jī)制及治療靶點(diǎn)意義深遠(yuǎn)。

缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)最初是由 Semenza 在 1991 年發(fā)現(xiàn)的，是1種氧依賴的轉(zhuǎn)錄激活因子，由 HIF-1α和 HIF-1β 2個(gè)亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，其中HIF-1α分子大小約為 120 kD，是氧敏感亞基，低氧條件下可被誘導(dǎo)表達(dá)并累積[1，3-4]。HIF-1α調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄，如調(diào)節(jié)糖酵解、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和血管生成[5]，由于其在惡性腫瘤細(xì)胞中的特異性表達(dá)和HIF在體內(nèi)的廣泛分布，HIF-1α基因正日益成為腫瘤治療研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)課題之一。文獻(xiàn)中HIF-1α在HBV感染相關(guān)性肝癌中的研究較少。通過本課題研究觀察，HIF-1α在HBV感染相關(guān)性肝癌中表達(dá)明顯高于沒有合并HBV感染的HCC組，這可能與病毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞代謝改變，加重細(xì)胞缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的進(jìn)展相關(guān)。如果能有效地抑制HIF-1a的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)腫瘤缺氧過程導(dǎo)致的促進(jìn)腫瘤發(fā)生的或可能為肝癌治療帶來新的機(jī)遇。另外，有研究發(fā)現(xiàn)MITF可轉(zhuǎn)錄激活HIF-1α而促進(jìn)腫瘤血管生成[6]。本課題組經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，盡管MITF可能在部分肝癌細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞系中表達(dá)，但是在肝癌的組織中卻未見理想的表達(dá)，因此肝癌中HIF-1a的激活可能與MITF的關(guān)系不大。

CRP是機(jī)體受到微生物入侵或組織損傷等炎癥性刺激時(shí)肝細(xì)胞合成的急性相蛋白，是臨床上常用的急性時(shí)相反映指標(biāo)，后被證實(shí)在多數(shù)腫瘤患者的血清中呈高水平表達(dá)，其濃度與腫瘤的侵襲和患者的生存率有關(guān)[7]。腫瘤患者血清CRP水平的升高很可能是繼發(fā)于腫瘤壞死、局部組織損傷及炎癥的一個(gè)反應(yīng)。CRP的檢測(cè)對(duì)惡性疾病的評(píng)估有重要的臨床價(jià)值。NLR可能是反映全身炎癥狀態(tài)的良好指標(biāo)，與肝細(xì)胞癌大小、TNM分期、門靜脈癌栓和AST等臨床病理指標(biāo)相關(guān)，同時(shí)NLR是肝細(xì)胞癌肝切除術(shù)患者總體生存的獨(dú)立預(yù)后因素[8-11]。HBV感染相關(guān)性HCC中CRP、NLR的表達(dá)情況如何，目前文獻(xiàn)報(bào)道的較少。本實(shí)驗(yàn)通過觀察CRP、NLR在HBV相關(guān)性肝癌中表達(dá)情況來了解該類型肝癌的特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染HPV組中CRP、NLR均明顯高于未感染HPV組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，HBV感染相關(guān)性HCC機(jī)制可能與乏氧相關(guān)，與炎癥反應(yīng)有一定的相關(guān)性。針對(duì)HBV感染相關(guān)性HCC的治療可以更多地關(guān)注抑制乏氧過程，兼顧抑制腫瘤發(fā)生中的炎癥反應(yīng)過程。本研究還有許多不足之處，繼續(xù)尋找調(diào)控HBV感染相關(guān)的HCC發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因子和分子靶點(diǎn)將是肝癌治療的關(guān)鍵。