CapG表達與胃癌患者特征及腫瘤細胞遷移、增殖能力的關系

陳雅寧 朱瓊瓊 秦建領

胃癌是死亡率最高的癌癥之一，患者預后較差，目前尚缺乏特定的診斷指標[1-2]。因此，針對胃癌的發(fā)生發(fā)展過程急需找尋一些新的標記物，為胃癌的診斷及治療提供新的靶點，以改善患者生存率[3-4]。巨噬細胞加帽蛋白(CapG)是1種肌動蛋白結合蛋白，其發(fā)揮作用的機制是通過給微絲末端加帽來對微絲運動進行控制，從而對細胞形態(tài)及功能進行調節(jié)，最終影響腫瘤細胞的侵襲與遷移過程[5]。CapG高表達后，其通過作用于肌動蛋白的非肌肉細胞時，控制其運動后，使正常細胞的生理過程發(fā)生紊亂，并能調節(jié)腫瘤細胞的結構及功能[6-7]。肌動蛋白和肌動蛋白結合蛋白可看作成一組促進腫瘤因子，可指導腫瘤的診斷及治療[8]。本研究通過免疫組化技術檢測了癌組織及癌旁組織CapG的表達情況，并應用CapG轉染技術，探究CapG對胃癌細胞遷移能力的影響，以探討CapG對腫瘤細胞增殖、遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 資料

選取我院收治的病理科收集的手術后胃癌組織標本80例、40例胃癌癌旁組織標本，標本獲取時間2016年2月至2018年10月，納入標準：①胃癌的診斷標準參考2015年NCCN《腫瘤學臨床實踐指南·胃癌》部分的標準；②患者術前經CT、胃鏡取活組織檢查及術后病理學證實；③手術獲取標本前患者未接受放療、化療、靶向療法等；④研究對象的各項基礎資料完整；⑤本研究遵守相關醫(yī)學倫理學要求，對患者的各項資料保密。排除標準：①資料不全；②未經病理學證實；③術前具有放療、化療、靶向療法史。

胃癌組，年齡43～79歲，平均(62.5±7.2)歲；男性47例、女性33例；腫瘤分化程度：高分化22例、中分化30例、低分化28例；AJCC分期：Ⅰ期15例、Ⅱ期40例、Ⅲ期20例、Ⅳ期5例；腫瘤病灶最大直徑≤3.0 cm 45例、腫瘤病灶最大直徑>3.0 cm 35例；淋巴結轉移陽性43例。癌旁組織，年齡46～75歲，平均(61.3±6.6)歲；男性21例、女性19例。兩組患者的年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 將采集的癌組織及癌旁組織固定在10%中性福爾馬林中，進行常規(guī)石蠟切片制作以及常規(guī)免疫組織化學染色，常規(guī)進行脫蠟、脫水操作，將脫水后的玻片用蒸餾水沖洗以使組織清晰。進行抗原修復，然后將其浸泡在3%H2O2溶液中10 min，以阻斷內源性過氧化氫酶活性。再用血清進行封閉；將稀釋度為1∶200的一抗孵育組織，置于4 ℃搖床上孵育一夜，一抗孵育后，用PBS洗滌玻片3次，每次5 min，接下來進行二抗孵育，加入辣根過氧化物酶，在37 ℃下孵育半小時，同樣用PBS洗滌3次；進行常規(guī)染色、脫水、透明，用中性膠密封，在顯微鏡下觀察。免疫組織化學評分由兩名病理學家使用雙盲方法獨立完成。

CapG蛋白陽性在細胞核中表達，陽性表達為黃色，①按染色程度分為：不染色(0分)，僅淡黃色(1分)，棕黃色(2分)，棕黑(3分)；②根據染色細胞百分比結果：≤10%得分為1分，百分比范圍為11%～50%得分2分，比例范圍為51%～75%得分3分，比例> 75%得分為4分，染色度與陽性細胞得分乘積<3為負，≥3為陽性[9]。

1.2.2 BGC-823胃癌細胞培養(yǎng)及轉染 將表達CapG慢病毒的胃癌細胞系BGC-823接種到六孔板中，細胞密度約為30%。24 h后，添加2 ml含10 mg /l聚乙烯(polybrene)的CapG病毒上清液。48 h后，換液，并在72 h后加入篩選藥物嘌呤霉素。連續(xù)篩選5天后，在熒光顯微鏡下觀察熒光細胞的比例。

觀察細胞形態(tài)及狀態(tài)，確定細胞生長良好時，取一6孔板，于轉染前24 h，以每孔2×105的細胞量接種，接種后，將其置于37 ℃， 5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。準備轉染操作時，換液，加入稀釋后的病毒液，添加6微升聚乙烯(polybrene)于每孔中，這樣的目的是提高轉染效率，上述操作完成后12 h后來觀察細胞的狀態(tài)。如果與未轉染組沒有區(qū)別，請繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，取出棄掉病毒液體的舊培養(yǎng)基，然后換液。轉染48 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉染效率，再加入2微克/ ml嘌呤進行篩選并長期使用。轉染后，細胞長滿6孔板，然后常規(guī)傳代并凍存。

1.2.3 MTT實驗 根據常規(guī)傳代方法消化并計數每組細胞，然后在96孔培養(yǎng)板(邊緣孔中充滿無菌PBS)中每孔接種5×105個細胞，每孔含有0.2 ml完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板移至培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個樣品設有5個重復孔，將100微升濃度為0.5%的MTT溶液依次加入到每個孔并培養(yǎng)4 h后，除去上清液，并在此過程中注意不要除去Formazan晶體。向每個孔中添加150微升二甲基亞砜，將其置于搖床上，低速搖動10 min以完全溶解晶體，并在酶聯免疫測定中測量每個孔在490 nm處的吸光度。

1.2.4 Western-blot檢測 按照BCA試劑盒的操作測量總細胞蛋白的濃度，準備分離凝膠和濃縮凝膠，制備SD聚丙烯酰胺凝膠；按試劑盒說明取蛋白樣品及上樣緩沖液，1∶1混合后置于100 ℃水浴中高溫變性，依次進行電泳及電轉操作，將進行完電轉后的樣品轉移至PVDF膜上。轉移后用麗春紅染色，切下所需的對照蛋白標記物片段，并用5%脫脂奶粉密封1 h；孵育稀釋度為1∶1000的一抗，將密封膜置于一抗溶液中，排出氣泡，并密封袋口。于4 ℃下孵育過夜。以GAPDH內參，一抗孵育后，用TBST洗滌3次，每次10 min，再孵育二抗，再使用同樣的方法進行洗滌；顯影過程依據化學發(fā)光方法操作指南進行，將試劑盒中的A液和B液等量混合(注意存放在黑暗處)，顯影時使其浸潤在PVDF膜上，數分鐘后可以在凝膠成像儀上進行成像并用相應軟件進行分析。

1.2.5 Transwell實驗 讓細胞脫離血清12～24 h以消除血清的影響，用濃度為0.25%的酶蛋白酶對細胞進行常規(guī)消化，消化細胞，細胞消化后加入3倍體積的完全培養(yǎng)基，以1200 r/ min離心5 min，棄去上清液，使細胞懸液重懸于PBS中并反復離心2次，將加入Transwell室中的細胞數控制在1～10×105/ml。將Transwell室放入24孔培養(yǎng)板中，形成上下室。向24孔板中加入800 ml 4%(體積分數)的多聚甲醛，并在室溫下固定加熱20～30 min，用PBS洗滌兩次，然后在室溫下用0.1%(體積分數)的結晶紫染色溶液染色30 min，然后用PBS洗滌兩次。鏡下觀察 在倒置顯微鏡下觀察并拍照，計算穿過小室膜的細胞數。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁組織中CapG蛋白表達情況

胃癌組織中的CapG蛋白陽性表達率(68.75%)高于癌旁組織的(35.00%)，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 胃癌組織與癌旁組織中CapG蛋白表達情況(例，%)

2.2 胃癌組織CapG蛋白陽性表達與患者臨床病理特征的關系

在不同AJCC分期、是否發(fā)生淋巴結轉移的CapG蛋白陽性表達率組間比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 胃癌組織CapG蛋白陽性表達與患者臨床病理特征的關系(例，%)

2.3 胃癌細胞CapG沉默組、非沉默組的CapG蛋白表達情況

CapG沉默組CapG蛋白相對表達強度(0.573±0.135)顯著低于非沉默組(0.931±0.183)，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

1為非沉默組、2為CapG沉默組

2.4 胃癌細胞CapG沉默組、非沉默組的細胞增殖能力、細胞遷移能力比較

對胃癌細胞培養(yǎng)24 h、48 h，CapG沉默組和非沉默組患者的細胞增殖能力比較差異無統計學意義(P>0.05)；Transwell實驗檢測結果顯示，CapG沉默組的細胞穿過小室的細胞數目顯著低于非沉默組(P<0.05)，見表3。

表3 細胞增殖能力、細胞遷移能力比較

3 討論

胃癌的發(fā)生和發(fā)展機制復雜，是多種因素和多種基因共同作用的結果。其中，異常的細胞生長和增殖參與了胃癌的進程，目前有許多學者開始關注細胞骨架蛋白，細胞骨架蛋白是腫瘤細胞膜的主要成分，在腫瘤的轉移和浸潤中起關鍵作用[10-11]。細胞骨架的修飾和重建與細胞的遷移和浸潤密切相關，尋找參與細胞骨架形成的靶標可能成為將來抑制腫瘤轉移的靶標。

研究發(fā)現[12]，CapG蛋白與腫瘤轉移有關。當存在Ca2+時，CapG蛋白作為一種作用結合蛋白，可以與Ca2+結合，在F-action延伸末端加帽以防止其延伸，參與肌動纖維重塑，控制細胞凋亡并調節(jié)細胞行為。體外和體內研究表明CapG蛋白在腫瘤遷移中起作用，且與淋巴結轉移密切相關。也有報道稱，核內CapG的量與腫瘤的增殖有關，CapG的量越高，腫瘤的生長越快，但是關于其在胃癌中的作用的研究卻很少[13-14]。

大多數研究認為CapG與腫瘤增殖沒有明顯關系[6]，到目前為止，CapG與腫瘤遷移和增殖之間的關系仍存在爭議。不同的腫瘤具有不同的功能，它們的核外作用機制和核內調節(jié)機制有待進一步探討。我們研究了CapG與胃癌細胞BGC823遷移和增殖之間的關系。本研究結果顯示：胃癌組織中的CapG蛋白陽性表達率顯著較癌旁組織高。分析原因是：CapG與細胞骨架結合并作用后，能夠調節(jié)細胞的遷移行為。CapG蛋白還可能參與細胞內信號轉導過程，例如肌動蛋白的聚合和激活。胃癌發(fā)生淋巴結轉移的幾率較高，本研究發(fā)現不同AJCC分期、是否發(fā)生淋巴結轉移的患者之間CapG蛋白陽性表達率有顯著差異，提示CapG可能在腫瘤進展中起基礎性作，CapG是1種細胞骨架蛋白，細胞骨架是真核細胞中蛋白質纖維的網絡結構，細胞骨架蛋白可以通過某種機制與細胞骨架相互作用形成細胞，導致骨骼系統異常[15]。腫瘤細胞惡化后，腫瘤細胞內的微管結構發(fā)生變化，異常的微管結構使癌細胞的增殖能力增強，利于腫瘤發(fā)生淋巴結轉移，CapG還會增加肌動蛋白小體的水平，CapG通過在肌動蛋白絲的兩端添加帽調節(jié)肌動蛋白的行為，使核CapG經由核轉運受體到達細胞核，促進了腫瘤細胞的轉移。

本研究結果顯示：CapG沉默組CapG蛋白相對表達強度顯著低于非沉默組。表明CapG的表達在胃癌腫瘤的遷移過程中起重要作用。經嘌呤霉素篩選后，獲得了穩(wěn)定且低表達CapG的BGC823細胞，并初步探討了CapG在胃癌中的作用及其機制。CapG在通過C端F-肌動蛋白和微管結合序列調節(jié)骨架重排中起重要作用。研究報道，CapG可能經由Hippo-YAP信號通路發(fā)揮調節(jié)細胞增殖、凋亡過程，進而在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用。

本結果證明CapG在胃癌細胞BGC-823細胞中的過度表達對胃癌的增殖及遷移過程中起到促進作用，本研究結果顯示：Transwell實驗檢測結果顯示，CapG沉默組的細胞穿過小室的細胞數目顯著低于非沉默組。分析原因是因為：CapG的表達被抑制后，細胞克隆形成減少，增殖能力下降。轉染后，嘌呤霉素用于篩選獲得穩(wěn)定的低表達CapG，可以抑制EMT過程的發(fā)生，抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移，抑制腫瘤細胞的生長并促進胃癌細胞的凋亡。動物實驗發(fā)現[16]，在裸鼠的皮下荷瘤實驗中，發(fā)現CapG可以顯著抑制沉默后皮下腫瘤的體積和重量，腫瘤抑制信號途徑中 Hippo 信號通路中主要蛋白升高，并抑制腫瘤細胞的生長。

目前國內針對CapG蛋白與癌癥之間關系的研究相對欠缺，在胃癌中就更少有研究報道，本研究通過一系列研究證明了CapG蛋白與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關，這位胃癌的診治提供臨床參考，并指導了接下來的研究方向。

綜上所述，CapG蛋白在胃癌組織中表達上調，可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關，同時CapG蛋白高表達可促進胃癌細胞發(fā)生遷移。