雷公藤甲素對惡性黑色素瘤A375細(xì)胞EMT通路及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

王艷云 高明敏 姚 麗 張永紅

惡性黑色素瘤是惡性程度極高的皮膚惡性腫瘤[1-3]，具有高死亡率，而且侵襲性也較高，是目前引起男性死亡的第5大惡性腫瘤，是引起女性死亡的第6大惡性腫瘤，其發(fā)病機制較為復(fù)雜，目前仍然未完全研究清楚。中藥雷公藤為衛(wèi)矛科，雷公藤屬木質(zhì)滕本植物，從中分離提取的有效物質(zhì)已達(dá)數(shù)百種，如雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤多甙等，已經(jīng)研究證實具有抗炎、抗腫瘤等多種生物活性[4-6]。雷公藤甲素是中藥雷公藤中分離出的活性最高的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，也是雷公藤抗腫瘤藥效的主要成分。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有移行能力的間質(zhì)細(xì)胞的過程，在轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞獲得了侵襲和轉(zhuǎn)移能力，研究顯示[7-8]，EMT通路是惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的途徑之一。為此，本研究對雷公藤甲素對惡性黑色素瘤A375細(xì)胞EMT通路及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響進行了研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

人惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375細(xì)胞來源于北京中科院科研中心，雷公藤甲素來源于上海源葉生物科技有限公司，CCK-8來源于美國 Sigma公司，人抗鼠波形蛋白(Vimentin)抗體來源于美國 Santa Cruz公司，兔抗人缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)抗體、N-鈣黏素(N-cadherin)抗體來源于美國 CST 公司，胰蛋白酶來源于美國 Hyclone 公司，Matrigel 基質(zhì)膠來源于美國 BD 公司，Transwell 小室來源于美國Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 將冷凍儲存的A375細(xì)胞復(fù)蘇后置于含有10%FBS的完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度37 ℃，5%CO2的恒溫細(xì)胞孵育箱內(nèi)孵育培養(yǎng)。每間隔24h換培養(yǎng)液1次，在顯微鏡下觀察到培養(yǎng)的細(xì)胞已在培養(yǎng)基內(nèi)布滿80%面積后加入0.25%胰蛋白酶消化，后在離心機內(nèi)以3 000 r/min轉(zhuǎn)速、4 ℃溫度條件下離心，然后按照1∶2進行傳代培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，本研究所培養(yǎng)細(xì)胞均為對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2 A375細(xì)胞增殖狀態(tài) 采用 CCK-8 法檢測A375細(xì)胞增殖狀態(tài)。將培養(yǎng)好的A375細(xì)胞接種于96孔板，5 000個/孔，培養(yǎng)12 h后觀察到細(xì)胞貼壁，取0 mg/l、20 mg/l、40mg/l、60 mg/l濃度的雷公藤甲素母液分別加入上述培養(yǎng)孔板，每組5個復(fù)孔，分別對應(yīng)空白對照組、20 mg/l組、40 mg/l組、60 mg/l組，然后在溫度37 ℃，5%CO2的恒溫細(xì)胞孵育箱內(nèi)繼續(xù)孵育培養(yǎng)24 h，再每孔加入濃度為5 g/l、20 μl劑量的CCK-8，再孵育4 h，吸除掉培養(yǎng)液，再加入150 μl的 DMSO，震蕩10 min，促使晶體充分溶解，然后用波長為570的酶聯(lián)儀對每孔的吸光度值(OD)進行測定，計算出細(xì)胞生長抑制率。

1.2.3 A375細(xì)胞侵襲能力的測定方法 采取細(xì)胞侵襲實驗檢測，Matrigel細(xì)胞依據(jù)雷公藤甲素濃度進行分組，Matrigel細(xì)胞在4 ℃下過夜，用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋并后包被Transwell上室，成膠體，然后加入培養(yǎng)的A375細(xì)胞于上室，在下室內(nèi)加入5%的血清培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h，然后將未穿透微孔濾膜的細(xì)胞用無菌棉簽擦試干凈，固定，結(jié)晶紫染色，蒸餾水沖洗，顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)并且計數(shù)。

1.2.4 EMT通路及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá) 以Western Blot方法檢測EMT相關(guān)蛋白水平。A375細(xì)胞根據(jù)前述方法培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)之貼壁，吸除培養(yǎng)液，并且加入上述不同濃度的雷公藤甲素液，每組為6孔，在培養(yǎng)24 h后取出并且PBS清洗3遍，再加入細(xì)胞裂解液，后進行離心處理，以BCA法計算蛋白濃度，然后加入6×Loading buffer 上樣緩沖液沸水煮沸5 min 變性，取提取的蛋白用 SDS-PAGE凝膠進行分離和轉(zhuǎn)膜、溫室封閉等處理，最后加入目標(biāo)一抗蛋白，在4 ℃下孵育過夜，隔日進行TBST洗膜后加入目標(biāo)蛋白二抗然后在25 ℃下孵育1 h，再次TBST洗膜，最后ECL法顯影后對目標(biāo)蛋白表達(dá)水平以內(nèi)參蛋白β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后得到相對比值。采用 Image Lab 軟件測定分析表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度雷公藤甲素對A375細(xì)胞增殖能力的影響

不同濃度的雷公藤甲素對A375細(xì)胞進行處理后細(xì)胞存活率明顯不同，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=73.492，P<0.05)。雷公藤甲素對A375細(xì)胞的增殖能力在20 mg/l時已經(jīng)出現(xiàn)抑制，因此后續(xù)實驗均選擇此濃度，隨著雷公藤甲素濃度增加細(xì)胞存活率明顯下降，雷公藤甲素對A375細(xì)胞增殖的抑制具有濃度依賴性，見表1。

2.2 不同濃度雷公藤甲素對A375細(xì)胞侵襲能力的影響

不同濃度的雷公藤甲素對A375細(xì)胞進行處理后侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯不同，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=185.86，P<0.05)。隨著雷公藤甲素濃度增加侵襲細(xì)胞數(shù)量隨之下降，雷公藤甲素對A375細(xì)胞侵襲能力的抑制具有濃度依賴性，見表1。

表1 不同濃度雷公藤甲素對A375細(xì)胞存活率、侵襲能力的影響

2.3 不同濃度雷公藤甲素對A375細(xì)胞HIF-1α及EMT通路相關(guān)侵襲蛋白表達(dá)的影響

不同濃度的雷公藤甲素對A375細(xì)胞進行處理后HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=32.19、24.88、52.49，P均<0.05)。隨著雷公藤甲素濃度的增加，HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表達(dá)量隨之下降，見表2。

表2 不同濃度雷公藤甲素對A375細(xì)胞HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表達(dá)的影響

3 討論

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者病情不斷進展的主要原因，EMT信號通路是惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的途徑之一[7-8]，在此過程中上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，引起細(xì)胞基因和形態(tài)的改變，EMT信號通路主要包括撕裂原活化蛋白激酶信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路、Wnt/beta-catnin信號通路、NF-kB信號通路、Notch信號通路等[7-10]。腫瘤的低氧或者缺氧環(huán)境有助于大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，HIF-1α是EMT信號通路的主要調(diào)控因子，通過結(jié)合缺氧反應(yīng)元件調(diào)控靶基因的合成，最終影響到細(xì)胞的凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲等多個方面[11-13]。惡性腫瘤患者往往表現(xiàn)為HIF-1α的表達(dá)上調(diào)，同時，HIF-1α也能作為患者預(yù)后及病情嚴(yán)重程度的評價指標(biāo)。Vimentin、N-cadherin均為EMT信號通路相關(guān)蛋白，Vimentin基因位于染色體的10p13，屬于Ⅲ型中間纖維蛋白，Vimentin是EMT信號通路中的主要標(biāo)志物，EMT發(fā)生時Vimentin會出現(xiàn)高度表達(dá)，Vimentin在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲中均有重要意義，同時相關(guān)研究顯示Vimentin的表達(dá)下調(diào)后能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力[14-16]。N-cadherin是依靠結(jié)合鈣離子粘附糖蛋白，屬于間質(zhì)標(biāo)志物，主要在內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)等間質(zhì)組織中分布，能調(diào)節(jié)鈣離子介導(dǎo)的細(xì)胞間的粘附、細(xì)胞形態(tài)的維持和極性、細(xì)胞的遷移及識別等，在EMT信號通路中與Vimentin的作用相似，能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞從上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促使血管生成、腫瘤侵襲和遷移[17-19]。

惡性黑色素瘤是皮膚惡性腫瘤，近年來惡性黑色素瘤的發(fā)病率逐年升高，治療主要以手術(shù)切除為主，輔助以放化療等其他措施，但是患者生存率仍然較低。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，中藥在惡性腫瘤的治療中越來越受到重視，而且大量的研究顯示[20-22]，中藥很多有抗炎、抗腫瘤、改善免疫功能等作用。中藥雷公藤也被應(yīng)用在惡性黑色素瘤患者的治療中。研究顯示，雷公藤甲素具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等功效，在治療惡性腫瘤時能與化療藥物共同作用起到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，同時還能抑制腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性，其抗腫瘤時可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、降低細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種途徑發(fā)揮作用[16,22-24]。

本研究對雷公藤甲素對惡性黑色素瘤A375細(xì)胞EMT通路及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響進行了研究，對惡性黑色素瘤A375細(xì)胞進行體外培養(yǎng)，加入雷公藤甲素對A375細(xì)胞的增殖、侵襲能力等進行了實驗研究，結(jié)果顯示雷公藤甲素在體外不僅能抑制A375細(xì)胞的增殖，還同時能抑制其侵襲能力，同時觀察到隨著雷公藤甲素濃度增加細(xì)胞存活率、侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯下降，表明雷公藤甲素對A375細(xì)胞增殖和侵襲能力的抑制具有濃度依賴性，雷公藤甲素抑制A375細(xì)胞的增殖和侵襲能力是肯定的。同時，觀察不同濃度的雷公藤甲素對A375細(xì)胞進行處理后HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表達(dá)量，隨著雷公藤甲素濃度的增加，HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表達(dá)量隨之下降，推測明雷公藤甲素可能主要是通過抑制EMT信號通路及其相關(guān)蛋白的表達(dá)進而起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的作用，但是在此途徑中有無其他途徑共同作用，尚需要進行其他實驗進一步深入研究。

綜上所述，雷公藤甲素能抑制惡性黑色素瘤A375細(xì)胞中HIF-1α及Vimentin、N-cadherin表達(dá)，通過抑制EMT通路抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖及侵襲，且雷公藤甲素對惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的增殖和侵襲抑制具有濃度依賴性，但是由于雷公藤甲素也有一定毒副作用，因此尚需要后期進一步研究其抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲的最佳濃度，為日后臨床應(yīng)用雷公藤甲素治療惡性黑色素瘤提供更為安全有效的依據(jù)。