干旱脅迫下EMS 誘變花生后代突變體萌發(fā)期抗旱性評(píng)價(jià)

楊秀麗 ，寧東賢 ，周紅琴 ，趙玉坤 ，楊麗萍 ，李 楠

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，山西臨汾041000 2.臨汾職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西臨汾041000）

干旱是我國(guó)花生生產(chǎn)最主要的限制因子之一，我國(guó)70%的花生常年遭受不同程度的干旱脅迫，干旱引起的莢果減產(chǎn)率平均在20%以上[1-2]，年降雨量不足500 mm 的北方地區(qū)更是如此。干旱除直接造成產(chǎn)量損失外，還會(huì)降低種子級(jí)別、減少含油量、油質(zhì)變差以及增加黃曲霉的感染率。目前，市場(chǎng)上推廣的花生品種對(duì)干旱脅迫的耐受能力各不相同，因此，篩選和創(chuàng)制優(yōu)異抗旱種質(zhì)、選育抗旱性強(qiáng)的花生品種成為重要且普遍的抗旱措施。

利用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變抗旱種質(zhì)材料，獲得農(nóng)藝性狀優(yōu)良且抗旱性穩(wěn)定遺傳的突變體是抗旱選育的有效方法[3]。近年來(lái)，山西省南部地區(qū)麥茬復(fù)播花生播種期往往遭遇干旱少雨，不利于花生出苗，嚴(yán)重影響后期群體構(gòu)建。晉花8 號(hào)是抗旱性較強(qiáng)的花生品種，在晉南地區(qū)適宜春播種植，播種至成熟需要120～132 d。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所花生課題組采用EMS 誘變晉花8 號(hào)，經(jīng)過(guò)連續(xù)多代田間表型性狀調(diào)查與篩選，從M4 選出9 份農(nóng)藝性狀優(yōu)良、生育期較對(duì)照品種早5～11 d 的穩(wěn)定突變株系，其抗旱性較對(duì)照品種是否發(fā)生改變需要通過(guò)抗旱性鑒定和評(píng)價(jià)。由于種子萌發(fā)期是對(duì)干旱脅迫反應(yīng)最為敏感的階段之一，萌發(fā)生長(zhǎng)的優(yōu)劣極大影響后期群體構(gòu)建，因此，干旱脅迫下，種子萌發(fā)受到的影響對(duì)于篩選抗旱花生種質(zhì)具有重要意義[4-5]。PEG-6000 模擬干旱脅迫的方法具有操作簡(jiǎn)單、周期短、效率高且重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，因此，被廣泛應(yīng)用于作物早期抗旱種質(zhì)資源篩選與鑒定的試驗(yàn)中[6]。張智猛等[7]利用PEG-6000 模擬干旱脅迫的方法研究不同花生品種芽期的抗旱性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根長(zhǎng)、生根率和根干質(zhì)量與品種抗旱能力呈顯著正相關(guān)。

本研究利用18%的PEG-6000 模擬干旱逆境，采用隸屬函數(shù)法對(duì)10 份花生供試材料的萌發(fā)期抗旱性進(jìn)行綜合研究與評(píng)價(jià)[8]，旨在了解突變材料與對(duì)照品種晉花8 號(hào)之間的抗旱性差異變化，選出抗旱性更強(qiáng)的花生突變材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試10 份花生材料均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所花生課題組提供，其中9 份是突變材料（表1）。

表1 供試花生材料

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)前剝殼取出花生種仁，每份材料挑選成熟飽滿(mǎn)、大小一致的種仁，用75%的酒精消毒后，蒸餾水沖洗干凈，分別放在種子盒中用蒸餾水浸泡12 h，后取出種皮完整的種子，用濾紙吸干種子表面水分，擺放在直徑150 mm 的培養(yǎng)皿中，每皿20 粒，向其中加入30 mL 18%的PEG-6000 脅迫溶液，加等量的蒸餾水作為對(duì)照溶液，重復(fù)3 次，置于（28±1 ℃）暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)發(fā)芽，以放入培養(yǎng)箱時(shí)間為調(diào)查首日，之后每日固定時(shí)間觀察并記錄發(fā)芽情況，更換培養(yǎng)皿和脅迫液，以保持脅迫強(qiáng)度的穩(wěn)定性[9]。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

種子發(fā)芽以胚芽突破種皮、露出3 mm 的白色芽尖為標(biāo)準(zhǔn)。將第1 粒發(fā)芽之日定為該處理發(fā)芽的開(kāi)始期，之后每隔1 d 定時(shí)記錄發(fā)芽種子數(shù)，當(dāng)連續(xù)3 d 不再有種子發(fā)芽時(shí)作為發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束期。挑選10 粒正常生長(zhǎng)的發(fā)芽種子，測(cè)定其胚根長(zhǎng)（胚軸和主根的總長(zhǎng)度），計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和根長(zhǎng)脅迫指數(shù)[10-12]各項(xiàng)指標(biāo)。

式中，Sn1為 7 d 內(nèi)的發(fā)芽種子數(shù)；Sn0為供試種子總數(shù)；Sn2為 3 d 內(nèi)的發(fā)芽種子數(shù)；Gt指時(shí)間t內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt指相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；S為胚根長(zhǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與抗旱性評(píng)價(jià)方法

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中，對(duì)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行平方根反正弦轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行方差分析；當(dāng)方差分析結(jié)果顯著時(shí)，采用Duncan 法進(jìn)行多重比較，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的數(shù)據(jù)大小用平方根反正弦轉(zhuǎn)換后的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。

利用隸屬函數(shù)方法對(duì)各抗旱性指標(biāo)進(jìn)行鑒定和綜合評(píng)價(jià)。

式中，μ（xj）為各品種第j個(gè)性狀的隸屬函數(shù)值，xj為各品種某一指標(biāo)性狀的相對(duì)值（各指標(biāo)性狀相對(duì)值＝水分脅迫下性狀測(cè)定值/對(duì)照處理下性狀測(cè)定值），xmax和xmin分別為所有參試品種中第j個(gè)指標(biāo)性狀相對(duì)值的最大值和最小值，xij為i試材j指標(biāo)的相對(duì)值為所有供試材料j指標(biāo)的平均數(shù)[13-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下發(fā)芽指標(biāo)的變化差異分析

從圖 1、2 可以看出，18%PEG-6000 處理后的10 份花生材料，其發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照相比均發(fā)生了變化。10 份材料在蒸餾水和脅迫液的處理下發(fā)芽率均高于80%；對(duì)照處理時(shí)的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均高于干旱脅迫時(shí)的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，說(shuō)明干旱脅迫對(duì)種子的萌發(fā)有抑制作用。發(fā)芽勢(shì)在蒸餾水和脅迫液的處理下均較發(fā)芽率的變化幅度大，說(shuō)明干旱脅迫影響種子生活力，抑制了種子發(fā)芽速度和發(fā)芽整齊度。

從表2 可以看出，10 份材料在蒸餾水和18%PEG-6000 的處理下，其發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均存在極顯著差異（P＜0.01），說(shuō)明不同材料和干旱脅迫處理均對(duì)花生的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)存在極顯著影響。對(duì)于發(fā)芽率來(lái)說(shuō)，不同材料與濃度處理互作時(shí)的F＝0.554，P＝0.826＞0.05，說(shuō)明互作關(guān)系不明顯；而對(duì)于發(fā)芽勢(shì)來(lái)說(shuō)，不同材料與濃度處理互作的F＝3.002，P＝0.008＜0.01，說(shuō)明不同材料與濃度處理互作對(duì)發(fā)芽勢(shì)存在極顯著影響。從以上分析來(lái)看，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)可以反映不同花生材料在干旱脅迫處理下的差異性，用發(fā)芽指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)這10 份花生材料萌發(fā)期的抗旱性是可行的。

表2 不同處理下10 份花生材料發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的方差分析

由表3 可知，在干旱脅迫時(shí)，10 份花生材料發(fā)芽率大小順序?yàn)闀x花8 號(hào)（CK）＞4-8601＞4-8613＝4-8411 ＞4-8579 ＞4-8520 ＞4-8467 ＞4-8303 ＝4-8543＞4-8551，其中，晉花 8 號(hào)（CK）、4-8601、4-8613 和4-8411 的發(fā)芽率顯著高于其他材料；各材料發(fā)芽勢(shì)大小順序?yàn)?-8601＞4-8411＞晉花8 號(hào)（CK）＞4-8543 ＞4-8551 ＞4-8303 ＞4-8520 ＞4-8467＞4-8613＞4-8579，其中，4-8601、4-8411的發(fā)芽勢(shì)顯著高于其他材料；種子萌發(fā)期受到干旱脅迫時(shí)，發(fā)芽勢(shì)相比發(fā)芽率受到的影響更顯著，另外，突變材料中4-8601 和4-8411 的發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)均高于其他突變材料，表現(xiàn)突出。

表3 10 份花生材料在干旱脅迫時(shí)萌芽期的生長(zhǎng)情況

2.2 干旱脅迫下萌芽期抗旱性綜合評(píng)價(jià)

2.2.1 測(cè)定指標(biāo)的描述分析 為了消除材料之間的固有差異，采用各性狀相對(duì)值進(jìn)行抗旱性綜合評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括相對(duì)發(fā)芽率（X1）、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)（X2）、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)（X3）、相對(duì)活力指數(shù)（X4）、根長(zhǎng)脅迫指數(shù)（X5）。

對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行描述分析可以看出（表4），萌發(fā)期5 個(gè)測(cè)定指標(biāo)的相對(duì)數(shù)值均小于1，說(shuō)明10 份花生材料在干旱脅迫環(huán)境中的萌發(fā)生長(zhǎng)受到抑制，而各測(cè)定指標(biāo)間的變異程度是不同的；變異系數(shù)越大，此指標(biāo)下不同材料間表現(xiàn)的變異程度越明顯，能更好地描述干旱脅迫環(huán)境中材料間的差異性，依據(jù)變異系數(shù)大小排列各指標(biāo)在干旱脅迫下的敏感反應(yīng)程度為X4＞X5＞X2＞X3＞X1，即活力指數(shù)的敏感反應(yīng)程度最高。

表4 10 份材料發(fā)芽指標(biāo)的描述統(tǒng)計(jì)

2.2.2 萌發(fā)期抗旱性綜合評(píng)價(jià) 花生種子萌發(fā)期的抗旱性強(qiáng)弱受不同因素的綜合影響，使用單一測(cè)定指標(biāo)評(píng)價(jià)不同材料的抗旱性是片面的。本研究運(yùn)用隸屬函數(shù)法，以X1、X2、X3、X4和X5共 5 個(gè)指標(biāo)為依據(jù)，對(duì)9 個(gè)突變材料和晉花8 號(hào)的萌發(fā)期抗旱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析，結(jié)果用抗旱性度量綜合D 值來(lái)反映，通常情況下，D 值越高，表示該品種的抗旱能力越強(qiáng)，反之亦然。由表5 可知，10 份材料萌發(fā)期的5 個(gè)抗旱指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)D 值之間存在差異，說(shuō)明經(jīng)過(guò)EMS 誘變后的突變材料萌發(fā)期抗旱性發(fā)生了變化；D 值從大到小依次為4-8601＞晉花8 號(hào)（CK）＞4-8411 ＞4-8303 ＞4-8520 ＞4-8613 ＞4-8551＞4-8543＞4-8579＞4-8467；9 份突變材料中，4-8601 的綜合 D 值高于晉花 8 號(hào)（CK），其他突變材料的綜合D 值均低于晉花8 號(hào)（CK）。說(shuō)明4-8601 萌發(fā)期抗旱性最強(qiáng)，超過(guò)晉花 8 號(hào)（CK），而其他8 份突變材料的抗旱性相對(duì)較弱，其中，4-8467 抗旱性最弱。

表5 10 份花生材料抗旱評(píng)價(jià)隸屬函數(shù)值及綜合評(píng)價(jià)

3 結(jié)論與討論

種子萌發(fā)是花生生長(zhǎng)發(fā)育的開(kāi)端，其優(yōu)劣對(duì)后期群體構(gòu)建起著決定性作用，因而對(duì)種子萌發(fā)期的抗旱性鑒定和篩選有著重要意義[16]。PEG-6000 是一種高分子滲透劑，能調(diào)節(jié)滲透勢(shì)，利用它模擬干旱脅迫條件具有操作簡(jiǎn)單方便、重復(fù)性好等特點(diǎn)，現(xiàn)已被用于多種作物萌發(fā)期抗旱性快速鑒定和評(píng)價(jià)。本研究用18%PEG-6000 處理10 份花生材料后，其發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均低于對(duì)照蒸餾水處理，不同材料間亦存在顯著差異，而且發(fā)芽勢(shì)受到的影響較發(fā)芽率更明顯，也就是說(shuō)種子發(fā)芽速度和整齊度受到更大的抑制。

作物抗旱性是受多因素控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，不能單一只用一種指標(biāo)來(lái)鑒定和評(píng)價(jià)。本試驗(yàn)選取了發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和根長(zhǎng)脅迫指數(shù)5 個(gè)測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，各指標(biāo)對(duì)干旱脅迫的敏感反應(yīng)程度不同，其中，活力指數(shù)的變異系數(shù)最大，反應(yīng)最大，說(shuō)明干旱脅迫時(shí)，不同材料之間的種子發(fā)芽速率和生長(zhǎng)量的綜合反映差異較大。本試驗(yàn)旨在利用隸屬函數(shù)法來(lái)綜合評(píng)價(jià)花生萌發(fā)期的抗旱性，由此可知，突變后代材料與對(duì)照材料之間抗旱性的變化情況。從抗旱性度量值D 的大小可以判斷10 份材料間的抗旱性存在差異，其中，4-8601 的 D 值高于晉花 8 號(hào)（CK），其他突變材料的 D 值均低于晉花 8 號(hào)（CK）。說(shuō)明 4-8601 萌發(fā)期抗旱性最強(qiáng)，超過(guò)了晉花8 號(hào)（CK），而其他8 份突變材料的抗旱性相對(duì)減弱。

利用EMS 誘變抗旱材料，從后代中篩選生育期較對(duì)照縮短，且抗旱性不變或增強(qiáng)的種質(zhì)材料是本研究的培育目標(biāo)。本研究在種子萌發(fā)期進(jìn)行了抗旱性鑒定與篩選，初步評(píng)價(jià)了種質(zhì)材料萌發(fā)期的抗旱性強(qiáng)弱，但不能代表整個(gè)生育期的抗旱性。花生抗旱性是受到作物的形態(tài)特征、組織器官結(jié)構(gòu)、生理生化性狀等多種因素的控制[17]。張智猛等[18]、張俊等[19]、龍海濤等[20]利用隸屬函數(shù)法將多個(gè)生理生化或基因表達(dá)量性狀進(jìn)行綜合分析，從而評(píng)價(jià)種質(zhì)抗旱性。厲廣輝等[21]研究認(rèn)為，花針期和結(jié)莢期是花生生育進(jìn)程中的水分敏感期。因此，下一步研究將聚焦其他生育時(shí)期的相關(guān)農(nóng)藝性狀，以更完整地評(píng)價(jià)種質(zhì)材料的抗旱性。