lncRNA TTN-AS1靶向抑制miR-1271的表達對肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響及機制

陳哲，王勤寧，黃璐捷，史信寶，胡靜

寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院，浙江 寧波 315040，1.心胸外科；2.放療科

肺癌具有較高的發(fā)病率及病死率，多數(shù)患者在確診時已處于中晚期，治療效果及預(yù)后不理想[1]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，靶向治療成為肺癌治療的新方法，尋找有效的肺癌治療靶點具有重要意義。大 量研究表明，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）及微小RNA（microRNA，miRNA）與肺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，可作為肺癌診療的特異性靶點[2]。肌聯(lián)蛋白反義RNA1（titin antisense RNA1，TTN-AS1）是新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA，發(fā)揮促癌作用，有研究顯示，在甲狀腺癌、食管癌、骨肉瘤等多種腫瘤中l(wèi)ncRNA TTN-AS1異常表達，其表達可促進腫瘤進展[3-5]。有研究顯示，肺癌中TTN-AS1高表達，抑制其表達可降低癌細胞增殖、侵襲和遷移能力[6]。有研究報道，過表達miR-1271可在體內(nèi)體外抑制肺癌生長[7]；lncRNA TTN-AS1可通過靶向抑制miR-1271促進前列腺癌細胞的增殖和侵襲[8]。TTNAS1和miR-1271都可影響肺癌進展，且lncRNA TTNAS1和miR-1271存在靶向關(guān)系，但TTN-AS1是否可通過調(diào)節(jié)miR-1271影響肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡尚未可知。本研究以肺癌A549細胞為研究對象，旨在探討TTN-AS1調(diào)節(jié)miR-1271對肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響及可能的分子機制，為肺癌分子水平的治療提供一定的參考及依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、胎牛血清均購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑盒均購自美國Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa公司；CCK-8試劑盒購日本Djingo公司；Transwell小室購自美國Corning公司；細胞凋亡試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、RIPA裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin、cleaved caspase 3和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1 （3-phosphate dependent protein kinase 1，PDK1）抗體購自美國Abcam公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；RT-PCR儀購自瑞士Roche公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；FACScan流式細胞儀購自德國BD Biosicences公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人肺癌A549細胞購自美國ATCC。常規(guī)復(fù)蘇凍存的A549細胞后，使用含10% FBS及1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天換液1次，待細胞貼壁且占滿80%～90%培養(yǎng)皿面積時進行傳代。實驗選擇處于對數(shù)生長期的細胞。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染 采用Lipofectamine 2000進行細胞的轉(zhuǎn)染。選擇對數(shù)生長期的A549細胞，胰酶消化細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，按照2 mL/孔接種于6孔板，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞生長達70%～80%融合時，更換為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進行轉(zhuǎn)染。使用適量Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋Lipo 2000、TTN-AS1 siRNA（si-TTN-AS1）及陰性對照（si-NC）、pcDNA-TTN-AS1及空載體（pcDNA）、miR-1271 mimics及miR-NC、miR-1271 inhibitors（anti-miR-1271）及anti-miR-1271。將稀釋后的各轉(zhuǎn)染組與Lipofectamine 2000混勻，室溫靜置 30 min。將混合液加入6孔板內(nèi)，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育6 h，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實驗研究。

1.4 qRT-PCR檢測TTN-AS1和miR-1271表達 采用TRIzol法提取細胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA稀釋10倍，按照熒光定量試劑盒說明進行PCR擴增。每個樣本設(shè)置5個重復(fù)，相對表達量采用2-△△Ct法計算。所有引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：TTN-AS1：F：5’- CGGGAACAAGCCCTGTG-3’，R：5’-CCGGCCCAAAGATGATG- 3’；GAPDH：F：5’-TGCACCACCACCTGCTTAGC-3’，R：5’- GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’；miR-1271：F：5’-CTAGA CGTCCAGATTGAATAGAC-3’，R：5’-GTCCGAGCTTGGTC-AG AATG-3’；U6：F：5’-CTCGCTT-CGGCAGCACA-3’，R：5’-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3’。實驗重復(fù)3次。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖 以5×103個/孔將生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板，每孔100 μL細胞懸液，于培養(yǎng)箱常規(guī)孵育24 h，按照上述方法轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置5個重復(fù)。收集轉(zhuǎn)染48 h的細胞，在每孔加10 μL的CCK-8反應(yīng)液，混勻，于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h。酶標(biāo)儀檢測波長為450 nm的光密度值（OD值）。實驗重復(fù)3次。

1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲 Transwell小室上室加100 μL的Matrigel基質(zhì)膠（基質(zhì)膠:無血清培養(yǎng)基為1:4），待基質(zhì)膠凝固后進行實驗。收集按照上述分組轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞，胰酶消化細胞，不含血清培養(yǎng)基重懸細胞，并調(diào)整細胞濃度為5×105個/mL。取300 μL細胞懸液，加入Transwell小室上室，下室加500 μL含血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)24 h，去掉小室細胞培養(yǎng)液，PBS清洗，棉簽擦凈上室未穿過膜細胞，多聚甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下隨機選擇5個視野，計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞，胰酶消化細胞，并將細胞濃度調(diào)整為5× 105個/mL。預(yù)冷PBS洗滌細胞2次，加入binding buffer重懸細胞，離心，棄掉上清液，PBS洗滌細胞2次。加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育20 min。上機檢測前再加入300 μL的binding buffer，1 h內(nèi)通過FACScan流式細胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

1.8 Western blot檢測PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達 在轉(zhuǎn)染48 h 的各組細胞中加適量RIPA裂解液，冰上反應(yīng)30 min，4 ℃離心，收集上清液。取適量上清液，BCA法檢測蛋白樣品濃度。根據(jù)蛋白樣品體積加loading buffer，混勻，100 ℃變性5 min。按照40 μg/孔將變性蛋白加入至SDS-PAGE凝膠（5%濃縮膠和12%分離膠），電泳結(jié)束后4 ℃轉(zhuǎn)PVDF膜1.5 h，加5%脫脂奶粉封閉膜2 h。將膜放置在含PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3（1:1 000稀釋）的孵育盒中，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜。轉(zhuǎn)移膜至1:2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗中，室溫孵育1 h，洗膜。膜上滴加ECL顯色液，自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。Quantity One軟件分析各抗體條帶灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.9 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測結(jié)果顯示TTN-AS1和PDK1的3’UTR有可與miR-1271結(jié)合的位點。構(gòu)建含結(jié)合位點的TTN-AS和PDK1的野生型（WT）及突變型（MUT）3’UTR報告質(zhì)粒。以5×104個/孔將對數(shù)生長期的A549細胞接種于24孔板，待細胞生長達80%融合時，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明，將報告質(zhì)粒分別與miR-1271 mimics及miR-NC轉(zhuǎn)染至A549細胞，每組設(shè)3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測各組細胞熒光素酶活性。結(jié)果以螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性比值表示。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS21.0軟件進行分析。計量資料以±s表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制TTN-AS1表達對肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TTN-AS1 siRNA的A549細胞TTN-AS1表達明顯低于si-NC組（P＜0.05），表明構(gòu)建的抑制TTN-AS1表達的A549細胞成功。CCK-8實驗、Transwell實驗及流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-TTN-AS1組細胞增殖能力明顯降低，穿膜細胞數(shù)明顯下降，凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖1和表1。

圖1 抑制TTN-AS1表達對A549細胞凋亡和侵襲能力的影響

2.2 抑制TTN-AS1表達對A549細胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達的影響 Western blot結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-TTN-AS1組PI3K、p-AKT和PCNA表達明顯降低，E-cadherin和cleaved caspase 3表達明顯升高 （P＜0.05）。見圖2。

表1 抑制TTN-AS1表達后的A549細胞增殖、侵襲和凋亡情況

2.3 過表達miR-1271對肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-1271 mimics 的A549細胞TTN-AS1表達明顯低于si-NC組（P＜0.05），表明構(gòu)建過表達miR-1271的A549細胞成功。CCK-8實驗、Transwell實驗及流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-1271組細胞增殖能力明顯降低，穿膜細胞數(shù)明顯下降，凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖3和表2。

圖2 抑制TTN-AS1表達對A549細胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達的影響

2.4 過表達miR-1271對A549細胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達的影響 Western blot檢測PI3K/AKT信號通路及與細胞增殖、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達，結(jié)果顯示，與miRNC組比較，miR-1271組PI3K、p-AKT和PCNA表達明顯降低，E-cadherin和cleaved caspase 3表達明顯升高（P＜0.05）。見圖4。

2.5 TTN-AS1可靶向調(diào)控miR-1271的表達 生物信息學(xué)TargetScan軟件預(yù)測結(jié)果顯示（見圖5），TTNAS1與miR-1271序列中存在連續(xù)的結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示（見表3），miR-1271組野生型TTN-AS1熒光素酶活性較miR-NC組明顯降低（P＜0.05），而突變型TTN-AS1熒光素酶活性較miR-NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示（見表4），抑制TTN-AS1表達可明顯上調(diào)miR-1271表達，而過表達TTN-AS1可明顯下調(diào)miR-1271表達（P＜0.05）。說明lncRNA TTN-AS1與miR-1271存在靶向關(guān)系，且可負調(diào)控miR-1271表達。

圖3 過表達miR-1271對A549細胞凋亡和侵襲能力的影響

2.6 抑制miR-1271可逆轉(zhuǎn)抑制TTN-AS1對A549細胞增殖、侵襲和凋亡的影響 各組細胞增殖、侵襲和凋亡檢測結(jié)果顯示（見表5），與si-TTN-AS1組比較，si-TTN-AS1+anti-miR-1271組細胞增殖能力明顯降低，穿膜細胞數(shù)明顯下降，凋亡率明顯升高（P＜ 0.05）。Western blot檢測結(jié)果顯示（見表6），與si-TTN-AS1組比較，si-TTN-AS1+anti-miR-1271組PI3K、p-AKT和PCNA表達明顯升高，E-cadherin和cleaved caspase 3表達明顯降低（P＜0.05）。

表2 過表達miR-1271后的A549細胞增殖、侵襲和凋亡情況

2.7 TTN-AS1可調(diào)節(jié)miR-1271靶基因PDK1表達生物信息學(xué)預(yù)測軟件TargetScan預(yù)測結(jié)果顯示（見圖6），miR-1271和PDK1有可結(jié)合的位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示（見表7），miR-1271 mimics與野生型PDK1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而與突變型PDK1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05）。Western blot結(jié)果顯示（見圖7-8），過表達miR-1271和抑制TTN-AS1表達明顯下調(diào)PDK1表達，而抑制miR-1271表達和過表達TTN-AS1可明顯上調(diào)PDK1表達（P＜0.05）。提示miR-1271與PDK1存在靶向關(guān)系，miR-1271和TTN-AS1均可調(diào)控PDK1表達。

圖4 過表達miR-1271對A549細胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達的影響

圖5 TTN-AS1的序列含有與miR-1271互補的核苷酸序列

表3 TTN-AS1 WT/MUT與miR-1271 mimics共轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性

表4 lncRNA TTN-AS1調(diào)節(jié)miR-1271表達

3 討論

lncRNA是一類不編碼的RNA分子，長度大于200 nt，可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及翻譯水平的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。多種腫瘤中l(wèi)ncRNA異常表達，發(fā)揮促癌或抑癌作用，參與癌細胞的多種生物學(xué)過程[9-10]。lncRNA TTN-AS1是一個促癌基因，在多種腫瘤中高表達，如CHEN等[11]研究顯示，抑制TTNAS1表達可降低胃癌細胞的增殖和侵襲能力；LI 等[12]研究顯示，抑制TTN-AS1表達可降低骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，并促進細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，抑制TTN-AS1表達可降低A549細胞增殖和侵襲能力，并促進細胞凋亡。有研究顯示TTN-AS1可通過調(diào)節(jié)miR-142-5p/CDK5抑制肺癌細胞增殖、侵襲和遷移能力[13]。

表5 抑制miR-1271可逆轉(zhuǎn)抑制TTN-AS1對A549細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

表6 各組細胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3蛋白相對表達量

圖6 miR-1271的序列含有和PDK1互補的核苷酸序列

表7 PDK1 WT/MUT與miR-1271 mimics共轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性

圖7 過表達或抑制miR-1271對PDK1蛋白表達的影響

圖8 過表達或抑制TTN-AS對PDK1蛋白表達的影響

近年的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可作為miRNA“海綿”，降低組織及細胞中靶miRNA豐度，降低miRNA對mRNA結(jié)合作用及抑制mRNA翻譯，從而增強miRNA靶蛋白表達水平[14]。本研究結(jié)果顯示，TTN-AS1和miR-1271存在靶向關(guān)系，過表達TTN-AS1可下調(diào)miR-1271表達，抑制TTN-AS1表達可上調(diào)miR-1271表達。過表達miR-1271可明顯抑制A549細胞增殖和侵襲能力，并促進細胞凋亡，而抑制miR-1271可逆轉(zhuǎn)抑制TTN-AS1對細胞增殖、侵襲和凋亡的影響。提示TTN-AS1可靶向調(diào)節(jié)miR-1271影響肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡。PDK1是一個絲/蘇氨酸蛋白激酶，大小為67 kDa，在細胞生長、凋亡、分化等病理生理過程中發(fā)揮重要作用[15]。多種腫瘤中PDK1均呈現(xiàn)高表達，可作為一種原癌基因參與腫瘤進展[16-17]。有研究顯示，干擾PDK1表達可通過抑制AKT/FoxO1通路降低肺癌細胞增殖及促進細胞凋亡[18]。miR-1271可通過靶向PDK1調(diào)控AKT/MTOR信號通路促進胰腺癌細胞進 展[19]。本研究結(jié)果顯示，過表達miR-1271及抑制TTN-AS1均可下調(diào)PDK1表達，抑制miR-1271及上調(diào)TTN-AS1均可上調(diào)PDK1表達。提示TTN-AS1可通過調(diào)節(jié)miR-1271/PDK1影響肺癌細胞生長。

PI3K/AKT是一條與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號途徑，近年研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤中PI3K/AKT信號過度表達和活化[20-21]。AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白，PI3K可通過磷酸化Ser473和Thr308位點刺激AKT的活化，AKT活化后可通過調(diào)節(jié)下游分子表達，從而影響腫瘤生長[22]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，E-cadeherin是EMT過程的標(biāo)志物，其表達降低可促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[23]。Caspase 3 是凋亡相關(guān)的Caspase家族效應(yīng)蛋白，其活化可促進細胞凋亡[24]。有研究顯示，lncRNA TTN-AS1可通過調(diào)控PTEN/PI3K/AKT信號通路影響胃癌進展[25]。 本研究結(jié)果顯示，抑制TTN-AS1表達及過表達miR-1271均可下調(diào)PI3K、p-AKT和細胞增殖標(biāo)志物PCNA表達，上調(diào)E-cadherin和cleaved caspase 3表達，同時抑制TTN-AS1和miR-1271可逆轉(zhuǎn)抑制TTNAS1對PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達的影響；lncRNA TTN-AS1可通過靶向調(diào)節(jié)miR-1271/PDK1并抑制PI3K/AKT信號通路影響肺癌細胞生長。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)抑制lncRNA TTN-AS1表達可降低肺癌細胞增殖和侵襲能力，并促進細胞凋亡，機制可能與靶向miR-1271/PDK1分子并抑制PI3K/AKT信號通路有關(guān)。