脂肪乳劑通過激活自噬流解救布比卡因心肌毒性

林婷婷，施克儉，金周晟，張?jiān)?jiān)，夏芳芳，劉樂

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015

布比卡因是一種長效酰胺類局麻藥，因起效較快、作用時(shí)間長、麻醉效能較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床，但若誤入血管可誘發(fā)嚴(yán)重的心臟毒性，甚至心臟停搏。1998年WEINBERG等[1]發(fā)現(xiàn)脂肪乳劑可增加布比卡因的毒性閾值，隨后大量文獻(xiàn)都證實(shí)了脂肪乳劑可解救布比卡因心肌毒性[2-3]，但其機(jī)制仍不完全清楚。近幾年來，局麻藥和自噬的關(guān)系陸續(xù)被報(bào)道：丁卡因可造成Vero腎細(xì)胞自噬體的累積和溶酶體損傷[4]，布比卡因可抑制C2c12成肌細(xì)胞自噬流造成大量自噬體堆積[5]，而XIONG等[6]發(fā)現(xiàn)局麻藥可增加人成神經(jīng)細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞自噬體清除。但布比卡因是否通過調(diào)控自噬造成心肌毒性，脂肪乳劑是否通過調(diào)控自噬來解救布比卡因心肌毒性均鮮見報(bào)道。因此本研究通過建立布比卡因心肌毒性模型，用脂肪乳劑進(jìn)行處理，檢測心肌細(xì)胞損傷及自噬水平，探討自噬在脂肪乳劑解救布比卡因心肌毒性中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 H9C2心肌細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫。布比卡因（美國Sigma公司，B5274-5G），20%脂肪乳劑Intralipid（華瑞制藥有限公司，80EL046），胎牛血清（美國Gibco公司，10099-141），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，C11995500BT），CCK8細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒（日本DOJINDO公司，CK04），mRFP-GFPLC3雙標(biāo)腺病毒（上海漢恒生物科技有限公司，HBAP2100001），BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo公司，23227），微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule- associated protein 1 light chain 3，LC3）抗體（美國Novus公司，NB100-2220SS），p62抗體（英國Abcam公司，ab109012），反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒（美國Thermo公司，K1622），GAPDH、MAP1LC3、p62引物（上海生工生物工程股份有限公司），SYBR PCR試劑盒（日本Takara公司，RR820A）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠心肌H9C2細(xì)胞用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長面積達(dá)到90%左右，PBS清洗培養(yǎng)瓶，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心棄去消化液后用培養(yǎng)基重懸，吹打，制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液按1:4傳代，取100 μL、2 mL或者3 mL接種于96孔、6孔板或培養(yǎng)瓶中。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：用DMSO將布比卡因粉末配成 200 mmol/L的溶液作為存儲(chǔ)液，-20 ℃分裝保存，在使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋成1 mmol/L終濃度。20%的脂肪乳劑Intralipid在使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋成1%的終濃度。H9C2心肌細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，換成無血清培養(yǎng)基饑餓8～ 10 h后隨機(jī)分成空白溶劑組（DMSO組）、1 mmol/L 布比卡因組（Bup組）、1%脂肪乳劑組（Lip組）、1 mmol/L布比卡因聯(lián)用1%脂肪乳劑組（BLp組），各組用相應(yīng)藥物處理24 h。本實(shí)驗(yàn)布比卡因及脂肪乳劑的選用劑量及處理時(shí)間參考團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果[3]。

1.2.3 CCK8檢測細(xì)胞增殖抑制率：將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后用胰蛋白酶消化，離心重懸計(jì)數(shù)后，分別取100 μL至96孔板使其細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以100 μL無細(xì)胞的培養(yǎng)基做空白對(duì)照，待細(xì)胞長至70%左右按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行藥物處理，結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，用PBS 100 μL/孔清洗；按1:10體積比混合CCK8和無血清培養(yǎng)基DMEM，每孔100 μL加入待測孔中，37 ℃，5% CO2孵育4 h；用酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司，Plus384）測定450 nm波長吸光度。記錄每塊板的酶標(biāo)儀OD值。根據(jù)說明書公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.4 光鏡下觀察H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)：藥物處理結(jié)束后將各組培養(yǎng)瓶放置光學(xué)顯微鏡（日本Olymous公司，BX51）下觀察，在40、100、200三個(gè)倍數(shù)下拍照保存圖片。

1.2.5 電鏡下觀察H9C2心肌細(xì)胞自噬情況：藥物處理結(jié)束后，用細(xì)胞刮輕輕刮取細(xì)胞移到1.5 mL離心管，低速離心5 min，棄上清液，PBS清洗，離心成團(tuán)，加入新鮮2.5%戊二醛固定液，4 ℃過夜。取出固定液中心肌細(xì)胞，隨后用1%鋨酸固定1 h，緩沖液洗脫殘余鋨酸后，1%醋酸鈾塊染2 h，通過乙醇梯度脫水，純丙酮深度脫水2次，各10 min；包埋液:丙酮=1:1混合后37 ℃烘箱2 h，然后包埋液:丙酮=4:1 37 ℃烘箱過夜。第2天準(zhǔn)備好標(biāo)簽，標(biāo)記好組織名稱、編號(hào)。取出樣品轉(zhuǎn)移到另一新的 0.5 mL離心管中，加入純包埋液同時(shí)將標(biāo)簽紙貼壁放入離心管中，45 ℃烘箱3 h，65 ℃烘箱48 h。干燥后制作半薄切片和超薄切片，經(jīng)醋酸鈾-枸櫞酸鉛復(fù)染后在透射電鏡下觀察。

1.2.6 mRFP-GFP-LC3雙標(biāo)腺病毒檢測自噬流：將細(xì)胞狀態(tài)良好的H9C2心肌細(xì)胞鋪在激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL。貼壁24 h后，加入感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=300左右劑量的mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞，細(xì)胞放入培養(yǎng)箱孵化6 h后更換成新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染12 h后按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行藥物處理，結(jié)束后棄掉培養(yǎng)基加入5%的多聚甲醛固定10～15 min，之后DAPI染色5～10 min于激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡公司，TCSSP8X）下觀察拍照。RFP用于標(biāo)記及追蹤LC3，GFP在溶酶體酸性環(huán)境下容易淬滅，因此，GFP指示的綠色熒光斑點(diǎn)是自噬體，RFP指示的紅色熒光斑點(diǎn)是自噬體及自噬溶酶體，兩者合并呈現(xiàn)黃色熒光斑點(diǎn)（即GFP+/RFP+-LC3）表示自噬體，而紅色熒光斑點(diǎn)（即GFP-/RFP+-LC3）指自噬溶酶體。

1.2.7 Western blot檢測LC3II/I和p62蛋白相對(duì)表達(dá)量：藥物處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，加入4 ℃預(yù)冷PBS清洗，培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白提取劑及蛋白酶抑制劑（PMSF）（100:1配制）提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度并配置上樣蛋白。SDS-PAGE電泳將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1 h，之后用兔抗GAPDH（1:1 000）、兔抗LC3（1:1 000）、兔抗p62（1:1 000）等一抗4 ℃水平搖床孵育過夜，次日加入山羊抗兔IgG（H+L）HRP（1: 5 000）室溫孵1 h，后加入ECL發(fā)光液，用凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）自動(dòng)顯影讀取條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值。最后組間數(shù)據(jù)比較時(shí)，以DMSO組為對(duì)照組，計(jì)算其他組與DMSO組的相對(duì)值。

1.2.8 RT-PCR檢測MAP1LC3 mRNA和P62 mRNA的表達(dá)：藥物處理結(jié)束后，TRIzol法提取總RNA，用酶標(biāo)儀測定RNA的濃度和純度，A260 nm/A280 nm比值為1.8～2.0則認(rèn)為RNA純度合格。使用反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒將RNA合成cDNA，管家基因GAPDH的上游引 物序列為5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’，下游引物序列為5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’，MAP1LC3的上游引物序列為5’-CCTTCTTCCTGCTGGTGAAC-3’，下游引物序列為5’-CCGTCTTCATCCTTCTCCTG-3’；P62的上游引物序列為5’-CAAGATGGAGCCGGAGAATA-3’，下游引物序列為5’-CATGGCGTGAGTGAAGGAC-3’。以上述合成的cDNA為模板，按照SYBR PCR試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)體系，將上述反應(yīng)體系置Bio-Rad熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，95 ℃變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，熔解曲線為65～95℃，每5 s增加0.5℃。所有目的基因閾值與內(nèi)參相比較，計(jì)算2-ΔΔCT表示基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組H9C2心肌細(xì)胞增殖抑制率比較 DMSO組、Bup組、Lip組、BLp組細(xì)胞增殖抑制率分別為0.05±0.04、52.17±5.02，4.34±3.14，16.92± 3.09。與DMSO組比較，Bup組及BLp組的細(xì)胞增殖抑制率均顯著增高（P＜0.05）；與Bup組比較，Lip組及BLp組的細(xì)胞增殖抑制率均顯著下降（P＜0.05）；與Lip組比較，BLp組的細(xì)胞增殖抑制率顯著增高（P＜ 0.05）。

2.2 四組H9C2心肌細(xì)胞光鏡下形態(tài)比較 DMSO組細(xì)胞形態(tài)長梭型，細(xì)胞界限清楚，胞漿無雜質(zhì)，細(xì)胞核清楚；Bup組死亡細(xì)胞較多，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿雜質(zhì)多，看不清細(xì)胞核；Lip細(xì)胞狀態(tài)與DMSO組類似；BLp組與Bup組比較，漂浮死亡細(xì)胞大大減少，細(xì)胞界限清楚，胞漿清晰，胞核清楚。見圖1。

2.3 四組H9C2心肌細(xì)胞電鏡下自噬現(xiàn)象 電鏡下DMSO組未見明顯自噬現(xiàn)象，Bup組可見自噬體堆積，未見自噬溶酶體；Lip組的自噬溶酶體較Bup組多，自噬體較少；BLp組的自噬溶酶體較Bup組多，但比Lip組少。見圖2。

2.4 mRFP-GFP-LC3雙標(biāo)腺病毒檢測自噬流 Bup組出現(xiàn)自噬體堆積，卻未見自噬溶酶體；Lip組主要是自噬溶酶體，自噬體較少；相比較于Bup組，BLp組自噬體減少，但自噬溶酶體較多。見圖3。

2.5 四組H9C2心肌細(xì)胞LC3II/I、p62蛋白表達(dá)情況 與DMSO組比較，Bup組及BLp組LC3II/I蛋白表達(dá)均顯著增高（P＜0.05）；與Bup組比較，Lip組及BLp組均顯著下降（P＜0.05）。與DMSO組比較，Bup組及BLp組p62蛋白表達(dá)均顯著增高（P＜0.05）；與Bup組比較，Lip組及BLp組均顯著下降（P＜0.05）；與Lip組比較，BLp組顯著增高（P＜0.05）。見表1。2.6 四組H9C2心肌細(xì)胞MAP1LC3和p62 mRNA表達(dá)情況 與DMSO組比較，Bup組、Lip組及BLp組MAP1LC3 mRNA表達(dá)均顯著增高（P＜0.05）；與Bup組比較，Lip組及BLp組均顯著下降（P＜0.05）。與DMSO組比較，Bup組p62 mRNA表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與Bup組比較，Lip組及BLp組均顯著下降（P＜0.05）；與Lip組比較，BLp組顯著增高（P＜0.05）。見表1。

3 討論

本研究參照?qǐng)F(tuán)隊(duì)前期研究方法[3]建立布比卡因心肌毒性模型，用脂肪乳劑進(jìn)行處理，用CCK8法檢測細(xì)胞增殖抑制率及光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，布比卡因處理后細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，光鏡下漂浮死亡細(xì)胞較多，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿雜質(zhì)多，看不清細(xì)胞核，而用脂肪乳劑處理后細(xì)胞增殖抑制率顯著下降，漂浮死亡細(xì)胞大大減少，細(xì)胞界限清楚，胞漿清晰，胞核清楚，說明脂肪乳劑解救布比卡因心肌毒性模型制備成功。

圖1 光鏡下四組H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)比較

圖2 電鏡下四組H9C2心肌細(xì)胞自噬現(xiàn)象

圖3 激光共聚焦顯微鏡下四組H9C2心肌細(xì)胞自噬流現(xiàn)象（×400）

表1 四組H9C2心肌細(xì)胞LC3、p62蛋白及mRNA表達(dá)水平比較（每組n=5，±s）

表1 四組H9C2心肌細(xì)胞LC3、p62蛋白及mRNA表達(dá)水平比較（每組n=5，±s）

與DMSO組比：aP＜0.05；與Bup組比：bP＜0.05；與Lip組比：cP＜0.05

組別 LC3II/I蛋白 p62蛋白 MAP1LC3 mRNA p62 mRNA DMSO組 1.04±0.19 0.97±0.10 0.94±0.08 1.03±0.08 Bup組 4.36±1.40a 3.77±1.28a 2.12±0.48a 2.87±0.78a Lip組 2.07±0.50b 0.39±0.23b 1.40±0.34ab 0.60±0.12b BLp組 3.08±0.87ab 2.12±0.98abc 1.42±0.14ab 1.44±0.35bc

細(xì)胞死亡形式分為細(xì)胞壞死、凋亡性程序性細(xì)胞死亡和自噬性程序性細(xì)胞死亡三種類型[7]。自噬是幾乎所有的真核細(xì)胞高度保守的進(jìn)化過程。在正常情況下細(xì)胞自噬水平很低，但在細(xì)胞應(yīng)激條件下，如營養(yǎng)物質(zhì)消耗或氧化應(yīng)激時(shí)可激活自噬，降解異常蛋白質(zhì)，回收降解產(chǎn)物氨基酸，供細(xì)胞利用以維持細(xì)胞存活[8-9]。自噬的激活在心臟疾病中是一把雙刃劍。如在心力衰竭情況下自噬激活，將促進(jìn)肥厚性心肌病導(dǎo)致心力衰竭的異常蛋白降解，從而拮抗心室肥厚[10]；另一方面，過度的自噬損害正常有功能的蛋白和細(xì)胞器，導(dǎo)致心功能不全[11]。而細(xì)胞自噬水平的下降又將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的堆積，最終引發(fā)心肌疾病[12]?？偠灾?，自噬在心室肥厚疾病[10]、心力衰竭[11]、心臟缺血再灌注[13-14]等過程中都有參與調(diào)控。

自噬的一個(gè)主要特點(diǎn)是自噬體的形成。ERICSSON[15]首次用透射電鏡技術(shù)詳細(xì)研究了具有雙膜結(jié)構(gòu)包裹著受損的細(xì)胞器或者異常蛋白質(zhì)等的自噬體。LC3在翻譯后加工成水溶性胞漿形式的LC3I，LC3I與磷脂酰乙醇胺綴合形成脂溶性膜型的LC3II，其被招募定位在自噬體膜，故LC3的轉(zhuǎn)化（LC3II/I）或LC3II的水平被廣泛認(rèn)可用作自噬體的量化標(biāo)志物[16]。本研究結(jié)果顯示布比卡因處理后電鏡下出現(xiàn)了大量雙膜結(jié)構(gòu)的自噬體，LC3II/I蛋白及基因表達(dá)明顯增高，而用脂肪乳劑處理后電鏡下自噬體數(shù)量及LC3II/I蛋白表達(dá)均有所減少。上述結(jié)果表明布比卡因可造成自噬體的堆積，而聯(lián)用脂肪乳劑處理可改善這一現(xiàn)象。

自噬在細(xì)胞內(nèi)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，涉及自噬體生成和清除兩個(gè)階段，因此布比卡因造成心肌細(xì)胞自噬體的堆積表明自噬體生成增加或自噬體清除減少。為進(jìn)一步探討自噬在脂肪乳劑解救布比卡因心肌毒性中的作用，本研究采用了mRFP-GFP-LC3雙標(biāo)腺病毒來監(jiān)測自噬體轉(zhuǎn)化為自噬溶酶體的動(dòng)態(tài)過程（自噬流），結(jié)果顯示布比卡因處理后出現(xiàn)大量黃色熒光斑點(diǎn)，卻未見紅色熒光斑點(diǎn)，而聯(lián)用脂肪乳劑處理后黃色熒光斑點(diǎn)減少，出現(xiàn)紅色熒光斑點(diǎn)，說明布比卡因主要通過抑制自噬體清除造成自噬體的堆積，而脂肪乳劑可激活自噬流加快自噬體清除。

p62是自噬的特異性底物，通過與LC3直接結(jié)合從而定位于自噬體中，參與自噬體選擇性的清除過程，因此可通過檢測p62蛋白的表達(dá)來評(píng)估自噬體清除情況[5，14]。本研究結(jié)果顯示，布比卡因處理后p62蛋白及mRNA表達(dá)均明顯增加，這結(jié)果與LI等[5]的報(bào)道類似，而聯(lián)用脂肪乳劑可下調(diào)p62的表達(dá)，進(jìn)一步說明布比卡因造成自噬體清除障礙導(dǎo)致自噬體堆積，而脂肪乳劑促進(jìn)了自噬體的清除。

綜上所述，脂肪乳劑解救布比卡因心肌毒性，其機(jī)制與通過激活自噬流從而加快堆積自噬體的清除有關(guān)。