葫蘆科作物白粉病菌生理小種鑒定技術(shù)方案

李曉妮 鞏麗 王寶磊 孔凡慧 鄧云

摘 要： 為了明確白粉病菌生理小種及其地理分布，從病害癥狀、病原特征、鑒別寄主、接種方法、病害調(diào)查、生理小種鑒定等方面系統(tǒng)總結(jié)了葫蘆科作物白粉病菌生理小種鑒定技術(shù)方案，糾正了國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)中普遍存在的甜瓜寄主抗感反應(yīng)錯(cuò)誤，同時(shí)期望通過(guò)向國(guó)內(nèi)同行免費(fèi)提供13個(gè)甜瓜鑒別寄主的方式，明確我國(guó)瓜類白粉病菌生理小種及其地理分布，有針對(duì)性地開(kāi)展防治、種質(zhì)引進(jìn)和育種工作。

關(guān)鍵詞： 葫蘆科作物; 白粉病; 生理小種; 甜瓜鑒別寄主

中圖分類號(hào)：S65 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C 文章編號(hào)：1673-2871（2021）05-136-03

葫蘆科是世界上最重要的食用植物科之一，包含大約120個(gè)屬960個(gè)種，其重要性僅次于禾本科、豆科和茄科。常見(jiàn)的葫蘆科作物有西瓜、甜瓜、黃瓜、南瓜、西葫蘆、苦瓜等，不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，有些還兼具藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，在居民的日常生活中占據(jù)重要地位。

白粉病是嚴(yán)重危害葫蘆科作物的世界性病害，常導(dǎo)致產(chǎn)量和和品質(zhì)的大幅下降。危害葫蘆科作物的白粉病病原菌主要有2種，分別為白粉菌屬二孢白粉菌（Golovinomyces orontii s.l.）和單囊殼屬單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii），其中單囊殼白粉菌主要發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū)以及保護(hù)地栽培條件下，在全世界絕大部分地區(qū)是優(yōu)勢(shì)種[1]。白粉病菌在致病性和毒力上具有極強(qiáng)的變異性，分化快、生理小種眾多，僅單囊殼白粉菌生理小種報(bào)道的就有36種之多[2]，且還存在不能確定的生理小種，給白粉病生理小種的準(zhǔn)確鑒定和命名帶來(lái)了極大的困擾。

Lebeda等[1]提出了一套系統(tǒng)的葫蘆科作物白粉病生理小種鑒定和命名方法，包括21個(gè)甜瓜鑒別寄主、3組7個(gè)數(shù)字的小種簡(jiǎn)明命名方法、白粉病菌和鑒別寄主的保存、標(biāo)準(zhǔn)接種鑒定方法等。但由于鑒別寄主太多，操作繁瑣，導(dǎo)致該方法的應(yīng)用范圍非常有限。目前國(guó)際通用的鑒定方法還是利用13個(gè)甜瓜鑒別寄主對(duì)白粉病菌生理小種的抗感反應(yīng)進(jìn)行鑒定，該方法可以準(zhǔn)確鑒定11個(gè)單囊殼白粉菌和2個(gè)二孢白粉菌生理小種，基本能夠滿足葫蘆科作物白粉病生理小種的鑒定需求[2]。

筆者于2020年在國(guó)內(nèi)報(bào)道了白粉病生理小種N2在山東省濰坊市峽山區(qū)的發(fā)生[3]。在研究過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)諸多研究普遍存在甜瓜鑒別寄主對(duì)白粉病菌生理小種的抗感反應(yīng)標(biāo)注錯(cuò)誤和不全、命名方法不規(guī)范、接種方法隨意、病害調(diào)查分級(jí)不明確等問(wèn)題。因此，筆者以2019年和2020年連續(xù)2 a （年）、山東濰坊和寧夏中衛(wèi)兩地、春茬和秋茬兩季、植物生長(zhǎng)室和塑料大棚兩種環(huán)境下的重復(fù)試驗(yàn)為基礎(chǔ)，結(jié)合前人研究結(jié)果以及與美國(guó)McCreight等專家的交流，制定了葫蘆科作物白粉病菌生理小種鑒定技術(shù)方案，以期能夠?yàn)閲?guó)內(nèi)同行準(zhǔn)確鑒定葫蘆科作物白粉病菌生理小種提供幫助。

1 葫蘆科作物白粉病病害癥狀

白粉病是一種專性寄生真菌病害，在葫蘆科作物的整個(gè)生長(zhǎng)周期均可發(fā)生。該病害癥狀非常明顯，主要表現(xiàn)為：在植株子葉、葉片、莖稈以及果實(shí)上產(chǎn)生白色粉狀物。一般自下而上發(fā)病，發(fā)病初期在侵染部位長(zhǎng)出白粉狀霉層，然后逐步變黃枯死，晚期在侵染部位會(huì)長(zhǎng)出黑色小顆粒（圖1）。由于白粉病是多循環(huán)的真菌病害，繁殖周期短、繁殖率高，產(chǎn)生的孢子通過(guò)空氣大范圍傳播，因此能夠在一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)內(nèi)多次重復(fù)侵染葫蘆科作物，導(dǎo)致植株冠層的大面積減少，嚴(yán)重時(shí)葉片干枯，導(dǎo)致葫蘆科作物的產(chǎn)量和品質(zhì)的降低。

2 葫蘆科作物白粉病病原特征

危害葫蘆科作物的白粉病病原菌主要有單囊殼屬單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii.簡(jiǎn)稱Px）和白粉菌屬二孢白粉菌（Golovinomyces orontii s.l.簡(jiǎn)稱Go），在我國(guó)Px是優(yōu)勢(shì)種。

單囊殼白粉菌（Px）分生孢子為橢圓形，分生孢子上有發(fā)達(dá)的纖維狀體，萌發(fā)管叉狀或頂端膨脹，從分生孢子的側(cè)面長(zhǎng)出，子囊數(shù)1個(gè)，子囊孢子數(shù)8個(gè)[4]。二孢白粉菌（Go）分生孢子呈細(xì)長(zhǎng)圓柱形，分生孢子上沒(méi)有纖維狀體，萌發(fā)管指狀，從分生孢子的頂端或底部長(zhǎng)出，子囊數(shù)10～15個(gè)，子囊孢子數(shù)2個(gè)[4]。目前，單囊殼白粉菌（Px）已被鑒定出生理小種11個(gè)，二孢白粉菌（Go）生理小種2個(gè)。葫蘆科作物白粉病菌生理小種演替很快，我國(guó)報(bào)道的生理小種均為單囊殼白粉菌（Px），包括race 1[4-6，8-11，13]、race pxCh1[7]、 race 2F[5-6，8]、 race 5[13] 和 race N1（race 6）[4]，優(yōu)勢(shì)生理小種為race 1[4，8，10-11]和race 2F[5-6，12]。

3 葫蘆科作物白粉病接種技術(shù)

3.1 材料準(zhǔn)備

3.1.1 病原菌收集及擴(kuò)繁 在葫蘆科作物白粉病暴發(fā)的田間，采集發(fā)病嚴(yán)重且沒(méi)有噴藥防治的病葉，裝進(jìn)保鮮袋并帶回實(shí)驗(yàn)室，立即用顯微鏡觀察白粉病病原菌的形態(tài)。

白粉病菌經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定確定歸屬，直接用于接種或擴(kuò)繁備用。收集的白粉病菌接種在西葫蘆或甜瓜感病鑒別寄主Iran H上擴(kuò)繁，方法為直接用毛刷蘸取白粉病病葉上的單斑接種到西葫蘆葉片正面。不同地區(qū)來(lái)源的菌株做好物理隔離，然后將接種的西葫蘆或甜瓜植株放置在生長(zhǎng)室，生長(zhǎng)室條件設(shè)置為溫度（26±2）℃/（16±2）℃（晝/夜）、光周期16 h/8 h（光照/黑暗）和濕度（75±10）%。

3.1.2 甜瓜鑒別寄主準(zhǔn)備 13個(gè)甜瓜鑒別寄主材料分別為：Iran H、Top Mark、Védrantais、PMR45、PMR5、WMR29、MR-1、PI 124111、PI 124112、PMR6、Nantais Oblong，由淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院饋贈(zèng);Edisto 47、PI 414723由United Genetics 提供。甜瓜鑒別寄主種子首先用5%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，用流水沖洗干凈后，將種子平放到鋪有兩層吸水紙的培養(yǎng)皿里，放置于30～32 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。待種子露白后，播種至32孔穴盤內(nèi)，每份材料播種5～10粒，重復(fù)3次，隨機(jī)排列。育苗基質(zhì)為V泥炭∶V蛭石∶V珍珠巖=3∶1∶1，育苗溫室溫度保持在（26±2） ℃/（16±2） ℃（晝/夜），確保鑒別寄主幼苗生長(zhǎng)健壯、整齊一致，無(wú)病蟲(chóng)害侵染。

3.2 白粉病菌接種

接種時(shí)期：待甜瓜鑒別寄主第3片真葉完全展開(kāi)時(shí)即可接種。接種方法：接種采用孢子懸浮液噴霧法。具體流程為：孢子懸浮液現(xiàn)配現(xiàn)用，不要超過(guò)2 h。首先準(zhǔn)備無(wú)菌蒸餾水滴加1‰ Tween-20，用毛刷將病葉上的新鮮白粉病菌孢子輕輕刷至無(wú)菌水中，輕輕攪拌混勻;然后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子濃度調(diào)至4×106個(gè)·mL-1。接著用噴霧器或噴壺把孢子懸浮液均勻噴到葉片表面，以霧滴布滿葉片但不流失為宜，并保證每片葉子均接種，接種后保持溫度（26±2）℃/（18±2）℃（晝/夜），濕度（75±10）%，弱光。接種后切忌在葉片上澆水，以免影響孢子萌發(fā)。

3.3 調(diào)查統(tǒng)計(jì)

接種15 d后調(diào)查寄主材料的發(fā)病情況。由于13個(gè)甜瓜鑒別寄主是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期試驗(yàn)篩選出來(lái)的，對(duì)白粉病生理小種的抗感反應(yīng)只存在抗?。≧）和感病（S）2種表型，不存在中間表型，因此在調(diào)查寄主材料發(fā)病情況時(shí)，如接種葉片出現(xiàn)白色分生孢子層，即可判定為感?。⊿），如接種葉片無(wú)癥狀或出現(xiàn)褐色壞死病斑，即可判定為抗?。≧）。參照表1 甜瓜鑒別寄主對(duì)白粉病菌生理小種的抗感反應(yīng)，確定白粉病菌生理小種。

4 注意事項(xiàng)

（1）白粉病菌隨氣流傳播，試驗(yàn)過(guò)程中做好生物隔離。（2）病菌產(chǎn)生分生孢子的適溫為15～30 ℃，高濕有利于孢子萌發(fā)和侵染，高溫干燥利于病害傳播。（3）甜瓜材料的抗感反應(yīng)以第3片真葉的癥狀表現(xiàn)為準(zhǔn)，部分抗病材料在子葉和莖稈也會(huì)表現(xiàn)白粉病癥狀，成株期后表現(xiàn)抗病。

參考文獻(xiàn)

[1] LEBEDA A，KRISTKOVA E，SEDLAKOVA B，et al. Cucurbit powdery mildews methodology for objective determination and denomination of races[J]. European Journal of Plant Pathology，2016，144（2）： 399-410.

[2] MCCREIGHT J D. Melon-powdery mildew interactions reveal variation in melon cultigens and Podosphaera xanthii races 1 and 2[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，2006，131（1）： 59-65.

[3] LI X N，KONH F H，GONG L，et al. First report of Podosphaera xanthii melon race N2 causing powdery mildew on cucumber in China[J]. Cucurbit Genetics Cooperative Report，2019，42（6）： 22-25.

[4] 魏尊苗.黑龍江省瓜類白粉病菌生理小種鑒定及其多樣性分析[D]. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[5] 包海青，許勇，杜永臣，等. 海南三亞地區(qū)葫蘆科作物白粉病菌生理小種分化的鑒定[J]. 長(zhǎng)江蔬菜，2008（1）： 49-51.

[6] 王娟，宮國(guó)義，郭紹貴，等. 北京地區(qū)瓜類蔬菜白粉病菌生理小種分化的初步鑒定[J]. 中國(guó)蔬菜，2006（8）： 7-9.

[7] LIU L Z，CHEN Y Y，SU Z H，et al.Sequence-amplified characterized region marker for a single，dominant gene in melon PI 134198 that confers resistance to a unique race of Podosphaera xanthii in China[J]. Hortscience，2013，45（9）： 1407-1410.

[8] 顧海峰，張旭，張文芳，等. 上海地區(qū)西甜瓜白粉病菌生理小種的鑒定[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，26（4）： 155-158.

[9] 王齊旭. 廣西苦瓜白粉病菌生理小種鑒定與抗白粉病SNP分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)[D]. 南寧： 廣西大學(xué)，2018.

[10] 張慧君，張佩，吳喬歆，等. 淮北地區(qū)甜瓜白粉病生理小種的鑒定[J]. 分子植物育種，2017，15（3）： 1084-1089.

[11] 劉東順，程鴻，孔維萍，等. 甘肅甜瓜主產(chǎn)區(qū)白粉病菌生理小種的鑒定[J]. 中國(guó)蔬菜，2010（6）： 28-32.

[12] 咸豐，張勇，馬建祥，等. 陜西關(guān)中地區(qū)瓜類白粉病菌生理小種的鑒定[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，38（10）： 115-125.

[13] 蘇瑞，王惠林，高強(qiáng)，等. 新疆部分地區(qū)籽用西瓜、甜瓜白粉病菌生理小種鑒定[J]. 中國(guó)蔬菜，2013（10）： 90-94.