茄子衰老葉質(zhì)體小球降解途徑的觀察

陳雯新 李萌 孫悅宸 毛新月 韓秋爽 劉林 張桂芝

摘? ? 要：采用透射電子顯微技術(shù)對茄子幼葉和衰老葉的質(zhì)體小球進(jìn)行了比較，并著重對衰老葉質(zhì)體小球的降解途徑進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明，茄子幼葉質(zhì)體小球小，電子染色深，老葉質(zhì)體小球大，電子染色淺;老葉中質(zhì)體小球發(fā)生降解，降解發(fā)生在葉綠體內(nèi)或液泡內(nèi)，顯示降解遵循葉綠體途徑或液泡途徑。在葉綠體途徑中，降解不是從質(zhì)體小球整個表面同時開始，而是從質(zhì)體小球表面某一點開始，降解區(qū)域電子透明，結(jié)果使質(zhì)體小球呈現(xiàn)為一側(cè)凸起而另一側(cè)凹陷。在液泡途徑中，液泡中的質(zhì)體小球由基質(zhì)包圍著，顯示質(zhì)體小球并不單獨進(jìn)入液泡，而是連同部分葉綠體基質(zhì)一起進(jìn)入液泡。

關(guān)鍵詞：茄子;葉衰老;質(zhì)體小球降解;降解途徑

中圖分類號：S641.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）05-109-04

Observation on the degradation pathways of plastoglobules in senescent eggplant leaves

CHEN Wenxin， LI Meng， SUN Yuechen， MAO Xinyue， HAN Qiushuang， LIU Lin， ZHANG Guizhi

（College of Pharmacy， Linyi University， Linyi 276005， Shandong， China）

Abstract： Plastoglobules in young and senescent eggplant leaves were observed comparatively and plastoglobule degradation pathways in senescent leaves were investigated， by means of transmission electron microscopy. Plastoglobules were less in number and size and more strongly stained in young leaves than in senescent leaves. Plastoglobules in senescent leaves underwent degradation inside either chloroplasts or vacuoles. Two pathways were demonstrated， chloroplast associated pathway and vacuolar pathway. During the chloroplast associated pathway， chloroplasts are the site for degradation. The degradation was found to happen from one side of the plastoglobule rather than the whole surface of the plastoglobule. As a result， the plastoglobule became convex on the intact side， but concave on the degrading side. During the vacuolar pathway， where vacuoles are the site for the degradation， plastoglobules were showed to be transported into the vacuole together with a portion of chloroplast stroma that surrounded the plastoglobules.

Key words： Eggplant; Leaf senescence; Plastoglobule degradation; Degradation pathway

電子顯微鏡剛開始用于細(xì)胞研究時就發(fā)現(xiàn)，葉綠體、有色體以及白色體等不同類型質(zhì)體中都存在一種嗜鋨小球體[1]，大小不等，直徑從30 nm到5 μm，由于小球體的脂含量非常高，因此稱為質(zhì)體小球[1-2]。后來進(jìn)一步研究表明，質(zhì)體小球是由半乳糖脂單分子層膜包圍甘油三酯所形成的細(xì)胞器，膜上結(jié)合一層蛋白質(zhì)[3-5]，甘油三酯中溶解有胡蘿卜素、類胡蘿卜素和維生素E[4-6]。質(zhì)體小球不僅發(fā)生在維管植物，也發(fā)生于蘚類植物[7]和藻類植物[3，5，8]。質(zhì)體小球的大小、數(shù)量和嗜鋨性因植物種類、質(zhì)體類型和發(fā)育階段而變化，這些特點顯示出質(zhì)體小球具有多方面生物學(xué)作用。最主要的作用是作為中性脂和胡蘿卜素的貯藏場所，其次， 質(zhì)體小球參與類囊體的發(fā)育及解體，體現(xiàn)在諸多方面，例如，在白色體中，質(zhì)體小球多則類囊體少，類囊體多而質(zhì)體小球少[9];葉綠體衰老時類囊體膜解體，質(zhì)體小球數(shù)量增多或體積增大[1，10-11];類囊體發(fā)育相關(guān)基因的突變體中，類囊體較少而質(zhì)體小球明顯增多[12-13]。葉綠體轉(zhuǎn)化成有色體之后，出現(xiàn)了類胡蘿卜素的微纖絲，成為有色體的重要特征，這些類胡蘿卜素微纖絲就來源于質(zhì)體小球[14-15]，顯然質(zhì)體小球在葉綠體向有色體轉(zhuǎn)化以及類胡蘿卜素微纖絲形成過程中起作用[16]。

葉衰老是葉發(fā)育的最后階段，是細(xì)胞組分有序降解、降解產(chǎn)物作為養(yǎng)分向植株生長部位轉(zhuǎn)移的過程[17-18]，質(zhì)體小球是貯藏大量中性脂的細(xì)胞器，它的降解產(chǎn)物對作物產(chǎn)量和品質(zhì)會有一定影響，因此研究質(zhì)體小球降解不僅具有理論意義也有實踐意義，然而目前對質(zhì)體小球降解的研究還很少[19-20]，質(zhì)體小球降解的途徑還不清楚。茄子是廣泛栽培的蔬菜作物，關(guān)于茄子質(zhì)體小球在葉衰老期間的降解途徑還尚未見報道。筆者采用透射電子顯微技術(shù)對衰老前后茄子葉中的質(zhì)體小球變化進(jìn)行觀察，以期了解質(zhì)體小球降解的亞細(xì)胞途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試茄子（Solanum melogena）品種為遼茄六號，由臨沂市種子公司提供。

1.2 方法

2018年3月進(jìn)行茄子育苗，4月將苗移栽于臨沂大學(xué)教學(xué)實驗基地大田內(nèi)，6月取樣。在離莖尖較近的位置取葉片正在擴(kuò)展的幼葉，從植株基部節(jié)上取淺綠色的老葉。于晴天10：00—11：00，從3株茄子上取樣，每株取3個幼葉和3個老葉。

1.3 透射電子顯微技術(shù)

從每片幼葉和老葉上剪下部分葉片，幼葉一組，老葉一組，分別置于盛有2%戊二醛固定液（磷酸緩沖液配制）中進(jìn)行初固定，帶回實驗室進(jìn)一步切成小于1 mm2小塊，12 h后再用1%四氧化鋨溶液固定12 h。用梯度酒精脫水，Epon 812樹脂包埋，然后切片，厚度60～70 nm。切片用檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色，在JEOL1220透射電鏡下觀察葉綠體。幼葉和老葉各觀察9個樣品。

2 結(jié)果與分析

由圖1-A可以看出，在尚未充分?jǐn)U展的葉片中，每個葉綠體的一個切片上可觀察到（8.6±1.6）個質(zhì)體小球，小球總是與類囊體靠在一起。質(zhì)體小球嗜鋨性強(qiáng)，電子密度大，呈現(xiàn)深黑色小球體，直徑小的只有0.02 μm，最大也不足0.2 μm，平均（0.06±0.02） μm。葉綠體基質(zhì)與類囊體的電子著色能力不同，基質(zhì)電子密度較小，類囊體電子密度大，因此基質(zhì)與類囊體形成的基粒之間有明顯反差?；５碾娮用芏扰c質(zhì)體小球電子密度相同，顯示質(zhì)體小球與類囊體之間的密切關(guān)系。這個時期的葉綠體積累淀粉粒，淀粉粒厚約0.5 μm，長1～2 μm，電子染色非常淺。葉綠體還向外伸展形成突起，突起中只有基質(zhì)，沒有類囊體。

植株基部的葉發(fā)生早，隨著株齡增大，這些葉首先開始自然衰老，成為衰老葉。電鏡下觀察，老葉一個葉綠體的一個切片上有（8.6±1.2）個質(zhì)體小球，與幼葉相比，質(zhì)體小球數(shù)量基本沒有明顯變化，然而質(zhì)體小球的體積則顯著增大，平均直徑增大到（0.7±0.1） μm，很多達(dá)到0.8 μm，比幼葉中的質(zhì)體小球直徑增大了10倍左右，體積增大數(shù)百倍至千倍，顯然，雖然葉衰老對質(zhì)體小球的數(shù)目沒有明顯影響，但引起小球體積劇烈增大（圖1-B～D）。質(zhì)體小球的內(nèi)部電子染色較淺，質(zhì)體小球的表面電子染色較深，結(jié)果小球表面與內(nèi)部形成較明顯的染色反差。蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的嗜鋨性，質(zhì)體小球表面染色深，表明質(zhì)體小球膜上結(jié)合有大量蛋白質(zhì)。質(zhì)體小球內(nèi)部與類囊體的電子染色非常接近，顯示兩者之間的嗜鋨性同步變化。類囊體電子染色變淺，與基質(zhì)間的電子密度差變小。衰老葉的葉綠體不含淀粉，顯示葉綠體衰老抑制淀粉積累。

大量觀察顯示，衰老葉的質(zhì)體小球發(fā)生降解，降解途徑有兩種：葉綠體途徑和液泡途徑。在葉綠體途徑中，質(zhì)體小球在葉綠體內(nèi)發(fā)生降解。在部分葉綠體的部分切片上能夠觀察到質(zhì)體小球降解，而不是所有的葉綠體或所有的切片上都能觀察到質(zhì)體小球降解，顯示質(zhì)體小球降解是不同步的。正在發(fā)生降解的質(zhì)體小球具有明顯的特征，表現(xiàn)為形狀不規(guī)則，不再呈球形，并且與電子透明的區(qū)域相聯(lián)系（圖1-C）。這一現(xiàn)象表明，降解不是在質(zhì)體小球整個表面發(fā)生，而是從質(zhì)體小球的一側(cè)發(fā)生，因此降解中的質(zhì)體小球不再呈球形，缺少了部分，致使不完整的這一側(cè)表面凹陷，而另一側(cè)是凸起的曲面（圖1-C）。盡管只能觀察到少數(shù)質(zhì)體小球發(fā)生原位降解，但大量的觀察表明降解現(xiàn)象是真實的，不是假象。

在液泡途徑中，質(zhì)體小球轉(zhuǎn)移到中央大液泡內(nèi)，在液泡內(nèi)降解。大量觀察表明，質(zhì)體小球進(jìn)入液泡后仍然被一層基質(zhì)包圍（圖1-D），這些基質(zhì)與葉綠體基質(zhì)形態(tài)特征一致，顯示質(zhì)體小球連同部分葉綠體基質(zhì)一起被液泡吞噬，一同進(jìn)入具有水解功能的液泡，而不是先離開葉綠體再進(jìn)入液泡。當(dāng)液泡內(nèi)出現(xiàn)質(zhì)體小球時，附近的葉綠體中質(zhì)體小球通常較少，表明液泡中的質(zhì)體小球就來自附近的葉綠體。含質(zhì)體小球較少的葉綠體（圖1-C～D）比含質(zhì)體小球多的葉綠體（圖1-B）略小，是部分質(zhì)體小球降解或與部分基質(zhì)一起離開葉綠體的結(jié)果。葉綠體中的質(zhì)體小球數(shù)不相等，表明質(zhì)體小球離開葉綠體或原位降解并不同步。

3 討論與結(jié)論

對大量樣品觀察的結(jié)果表明，茄子葉衰老引起質(zhì)體小球體積增大，質(zhì)體小球發(fā)生葉綠體內(nèi)降解或液泡內(nèi)降解。葉綠體中的質(zhì)體小球數(shù)沒有增加，有些葉綠體中質(zhì)體小球還減少，可能是小球降解的結(jié)果。質(zhì)體小球直徑增大10倍左右，體積增大數(shù)千倍左右，意味著衰老引起中性脂的合成量劇烈增加。用于合成中性脂的脂肪酸可能來自類囊體膜，是膜脂降解產(chǎn)物[21-22]。

本研究直觀顯示老葉中質(zhì)體小球降解，這與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果相互支持。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，葉衰老提高了脂肪酶基因表達(dá)水平[23-24]，即脂肪酶量增加，可能會參與類囊體膜脂組分的降解。

茄子葉質(zhì)體小球進(jìn)入液泡內(nèi)降解，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果顯示衰老葉部分表達(dá)水平升高的脂肪酶是定位于液泡內(nèi)的[23-24]，即液泡內(nèi)負(fù)責(zé)脂分子降解的酶隨著葉衰老而增多，這表明顯微鏡下的觀察結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析結(jié)果互為佐證，相互支持。茄子葉質(zhì)體小球向液泡中轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)過程，涉及到質(zhì)體小球和部分葉綠體基質(zhì)被液泡吞噬。細(xì)胞組分不經(jīng)自噬小體而直接被液泡吞噬并消化的過程屬于微自噬，而先形成自噬小體再被液泡或溶酶體消化的過程為巨自噬[25]。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示葉衰老大大增強(qiáng)自噬相關(guān)基因的表達(dá)[23]，間接支持茄子衰老葉質(zhì)體小球發(fā)生液泡內(nèi)降解的觀察。實際上，在西瓜[19]、黃瓜[20]和大豆[10]衰老葉中也觀察到了質(zhì)體小球發(fā)生液泡內(nèi)降解的現(xiàn)象，但質(zhì)體小球進(jìn)入液泡的方式不相同，茄子葉質(zhì)體小球連同葉綠體基質(zhì)一起進(jìn)入液泡，而西瓜、黃瓜和大豆衰老葉中質(zhì)體小球先從葉綠體分泌出來，再被液泡吞噬。

茄子葉質(zhì)體小球發(fā)生原位降解，即在葉綠體內(nèi)降解，這一現(xiàn)象也發(fā)現(xiàn)于西瓜[19]和黃瓜[20]衰老葉。質(zhì)體小球在葉綠體內(nèi)降解是否是普遍現(xiàn)象，還需要對更多植物做進(jìn)一步觀察。質(zhì)體小球在葉綠體內(nèi)降解涉及兩個重要過程，一是脂肪酶的轉(zhuǎn)運，一是降解產(chǎn)物脂肪酸的聚集。脂肪酸對細(xì)胞有毒性，因此脂滴降解產(chǎn)生的脂肪酸必須有隔離機(jī)制。在油性種子中這兩個過程已經(jīng)研究清楚，油性種子發(fā)芽時，乙醛循環(huán)體將脂肪酶運送到脂滴表面，并收集隔離酶解產(chǎn)物脂肪酸[26]。脂肪酸在乙醛酸循環(huán)體內(nèi)通過β-氧化途徑和乙醛酸循環(huán)途徑進(jìn)一步降解為小分子琥珀酸，琥珀酸再經(jīng)線粒體中的三羧酸循環(huán)和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的糖異生途徑轉(zhuǎn)化為可運輸?shù)头肿犹荹26]。衰老葉內(nèi)葉綠體中脂肪酶如何運輸?shù)劫|(zhì)體小球表面，質(zhì)體小球的降解產(chǎn)物如何聚集并隔離，都還有待于進(jìn)一步研究，對這些關(guān)鍵過程的了解有助于對葉綠體內(nèi)質(zhì)體小球降解機(jī)制的認(rèn)識。

茄子植株下部葉片發(fā)生衰老時，質(zhì)體小球降解產(chǎn)物最終以蔗糖的形式轉(zhuǎn)運到生長部位，對果實和新葉發(fā)育具有重要意義，但是要了解質(zhì)體小球降解與果實產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)系還需要做大量工作。

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