同位素稀釋-氣相色譜-三重四極桿質譜法測定食品中丙烯酰胺

◎劉朋宇

（沈陽市食品藥品檢驗所，遼寧 沈陽 110122）

食品中的丙烯酰胺（Acrylamide）主要是在食品熱加工過程中由游離的天門冬酰胺通過美拉德反應形成的[1-2]，2002年4月，瑞典國家食品管理局和斯德哥爾摩大學研究人員報道，在煎炸或烘烤土豆和谷物產品時會產生含量較高的丙烯酰胺[3]。2017年，世界衛(wèi)生組織把丙烯酰胺列在2 類致癌物清單中[4]。因此，對于食品中丙烯酰胺含量的檢測研究有很重要的意義。

目前，食品中丙烯酰胺的檢測方法通主要有氣相色譜法[5-6]、氣質聯(lián)用法[7-9]、液相色譜法[10-11]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[12-14]等。其中氣相色譜法靈敏度低、抗干擾能力差、定量準確性低，液相色譜-串聯(lián)質譜法存在保留時間短，樣品干擾物難以去除等問題。氣相色譜-串聯(lián)質譜法具有靈敏度高、選擇性強的特點，本實驗前處理步驟對國標[15]進行優(yōu)化，通過將丙烯酰胺衍生成2，3-二溴丙酰胺，采用氣相色譜-三重四極桿質譜法對食品中丙烯酰胺含量進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

市售餅干、面包和膨化食品，經粉碎處理，置于-18 ℃冰箱中保存。

丙烯酰胺、13C3-丙烯酰胺，純度均≥98%；正己烷、乙酸乙酯，均為色譜純；無水硫酸鈉、硫酸銨、硫代硫酸鈉、飽和溴水、氫溴酸、溴化鉀和大孔硅藻土（600～900 μm），均為分析純。

Intuvo9000-7000D 氣相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；R-300 旋轉蒸發(fā)儀、B-400 均質儀，瑞士步琦公司；MV5 氮吹儀，北京萊伯泰科；MS3 渦旋混合器，德國IKA 公司；H1750 離心機，湖南湘儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液和試劑的配制

（1）丙烯酰胺標準溶液。準確稱取丙烯酰胺純品，用超純水溶解并定容，將標準溶液用超純水分別稀釋至10 μg·L-1、50 μg·L-1、200 μg·L-1、500 μg·L-1和1 000 μg·L-1的標準工作液。

（2）丙烯酰胺內標（13C3-丙烯酰胺）溶液。準確稱取13C3-丙烯酰胺標準品，用超純水溶解并定容，將其稀釋至10 mg·L-1。

（3）溴試劑。稱取20 g 溴化鉀，加40 mL 超純水，使完全溶解，再加入1.0 mL 氫溴酸和16 mL 飽和溴水，搖勻，用超純水定容至100 mL，4 ℃避光儲存。

（4）0.2 mol·L-1硫代硫酸鈉溶液。稱取4.96 g硫代硫酸鈉用超純水溶解并定容至100 mL，4 ℃避光儲存。

1.2.2 前處理方法

稱取2 g 樣品于50 mL 離心管中，加入20 μL13C3-丙烯酰胺內標溶液，根據(jù)樣品的含水量加入10～15 mL 超純水，2 000 r·min-1振蕩提取20 min，然后于10 000 r·min-1離心2 min，取上清液，在上清液中加入硫酸銨15 g，振蕩5 min，于10 000 r·min-1離心2 min，取全部上清，備用。

在具砂板玻璃層析柱中，依次裝入10 g 無水硫酸鈉、2 g 硅藻土。稱取5 g 硅藻土與上述試樣上清液充分攪拌后，裝入層析柱中，靜置10 min。用60 mL 正己烷淋洗并棄去，用60 mL 乙酸乙酯以2 mL·min-1的速度洗脫，收集乙酸乙酯洗脫溶液于茄形瓶中，50 ℃旋轉蒸發(fā)至近干，用3 mL 乙酸乙酯分3 次洗滌茄形瓶殘渣，并將其轉移至已加入1 mL 超純水的試管中，渦旋振蕩。置于氮吹儀中吹去上層有機相后，待下一步衍生用。

在試樣提取液中加入1 mL 溴試劑，渦旋振蕩，4 ℃避光放置1 h，加入硫代硫酸鈉溶液50 μL，渦旋振蕩至無色；加入2 mL 乙酸乙酯，渦旋振蕩1 min，于4 000 r·min-1離心5 min，吸取上層乙酸乙酯相至另一試管，氮吹儀中40 ℃吹至近干，加0.5 mL 乙酸乙酯溶解，裝入1.5 mL 進樣瓶中，待測定。標準系列溶液的衍生：量取標準系列工作液各1.0 mL，加入20 μL13C3-丙烯酰胺內標溶液，按照上述試樣衍生步驟操作。

1.2.3 氣相色譜-質譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：HP-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：65 ℃保持1 min，15 ℃·min-1升至200 ℃，保持1 min，30℃·min-1升至250 ℃，保持5 min；載氣：高純氦氣，流速1 mL·min-1；進樣口溫度：250 ℃；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL。

（2）質譜條件。離子源：EI 源；離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲7 min；碰撞氣：氮氣，1.5 mL·min-1；淬滅氣：氦氣，2.25 mL·min-1。采集方式：多反應監(jiān)測（MRM）模式，離子監(jiān)測參數(shù)見表1。

表1 丙烯酰胺及其內標離子監(jiān)測參數(shù)表

2 結果與分析

2.1 丙烯酰胺的氣相色譜-三重四極桿質譜分析

多反應監(jiān)測（MRM）采集模式有著抗干擾、高靈敏度的特點，由于待測樣品成分復雜，選擇離子掃描模式存在假陽性，故選取MRM 模式進行采集。通過設定10 eV、15 eV、20 eV、25 eV 的碰撞電壓（CE），對丙烯酰胺和丙烯酰胺內標進行測定，試驗結果表明，子離子質核比越大，所需的CE 越小，通過比較其離子強度最終確定表1 中的質譜采集條件。

2.2 提取溶劑的選擇

丙烯酰胺屬于高極性化合物，易溶于水、乙醇、乙酸乙酯和丙酮。試驗比較了水、乙酸乙酯和丙酮的提取效果，結果表明，經乙酸乙酯和丙酮提取后，提取溶劑中含有較多的脂肪和色素，增加了后續(xù)凈化步驟的難度。由于水的極性強，樣品中的脂肪不易被提取，可減少測定時的干擾，所以本實驗選取水作為提取溶劑，與前人研究結論一致[16-17]。

2.3 洗脫液流速和用量的優(yōu)化

將2 g 大米粉做空白樣品按照1.2.2 進行處理，提取溶液加入200 ng 丙烯酰胺，以乙酸乙酯為洗脫溶劑對硅藻土進行洗脫，收集每10 mL 洗脫液為1 段，按1.2.2 步驟衍生并測定，其相對含量與洗脫溶劑的段數(shù)的關系見圖1。結果表明，當搜集至第6 段乙酸乙酯時，丙烯酰胺被完全洗脫，確定60 mL 為乙酸乙酯的最佳洗脫體積。丙烯酰胺的回收率與洗脫溶劑的流速呈相關性，流速越小，回收率越高，最終確定，流速為2 mL·min-1時，凈化效果和時間效率最佳。

圖1 每段洗脫溶劑中丙烯酰胺的相對含量圖

2.4 方法的線性范圍和定量限

按照1.2.3 的分析條件，分別取10 μg·L-1、50 μg·L-1、200 μg·L-1、500 μg·L-1和1 000 μg·L-1的標準工作液1 mL，按照1.2.2 中衍生步驟進行衍生和測定，通過內標法定量，得線性方程為y=0.006 858x，相關系數(shù)r=0.998 9。方法的定量限，在空白樣品中添加10 μg·kg-1的丙烯酰胺，經1.2.2 步驟處理，以10 倍信噪比計算丙烯酰胺的定量限，得其結果為5 μg·kg-1。

2.5 方法的準確度和精密度

為了驗證方法的準確性和可靠性，在面包中添加3 個濃度水平的丙烯酰胺，每個水平6 個平行樣，經過上述步驟進行樣品前處理和測定，同時對該樣品進行處理和測定，得其加標回收率和相對標準偏差（RSD），結果見表2。

表2 加標回收率和相對標準偏差結果表

由表2 可知，3 個濃度水平下，丙烯酰胺的回收率在86.5%～103.7%，相對標準偏差（RSD）為1.4%～4.3%，說明本方法準確度和精密度均能夠達到分析要求。面包樣品和加標樣品的MRM色譜圖見2。

圖2 面包樣品和加標樣品的MRM 色譜圖

2.6 實際樣品分析

在超市、農貿市場和便利店購買不同品牌的糕點、餅干和膨化食品共計92 份，采用本方法進行測定，結果表明，這3 種熱加工食品中不同程度的含有丙烯酰胺，其中最大含量為505 μg·kg-1。

3 結論

通過對丙烯酰胺的樣品前處理和測定條件的優(yōu)化，建立了食品中丙烯酰胺的氣相色譜-三重四級桿質譜儀測定方法，該方法的靈敏度高、準確性好，能夠滿足食品中丙烯酰胺的測定，通過對實際樣品的檢測，表明丙烯酰胺廣泛存在，為其安全標準限量的制定提供了數(shù)據(jù)基礎。