產(chǎn)黃原膠微生物的篩選和高產(chǎn)菌株的選育

李泓萱 張思雨 崔鵬飛 李 想 劉若寒 張彩鳳

（衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 河北 衡水 053000）

黃原膠用途非常廣泛，常被用作增稠劑、懸浮劑、乳化劑和穩(wěn)定劑，應(yīng)用于食品、陶瓷、醫(yī)藥、化妝品、紡織、藥品等多種行業(yè)，市場(chǎng)發(fā)展前景非?？捎^。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料。腐爛的紫甘藍(lán)；牛肉膏固體斜面培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉12 g，蔗糖45 g，蛋白胨5 g，NaCl 2.5 g，CaCO33 g，MgSO40.1 g，K2HPO4·3H2O 2.5 g，蒸餾水1 000 ml，pH 值7.0。

1.2 試驗(yàn)菌株篩選。采樣(從腐敗的紫甘藍(lán)上取樣)→營(yíng)養(yǎng)瓊脂增殖培養(yǎng)→TTC 影印法，從營(yíng)養(yǎng)瓊脂挑取TTC 對(duì)應(yīng)缺失的黃褐色單菌落→接種酵母膏、半乳糖、碳酸氫鈣瓊脂→挑取形成褐色水溶性色素的單菌落，并純化→檢測(cè)純化產(chǎn)物黃原膠。

1.3 黃原膠的發(fā)酵生產(chǎn)

1.3.1 種子培養(yǎng)液培養(yǎng)。挑取菌種活化傳代幾次，接種于裝有100 ml 種子液的500 ml 三角瓶中，28 ℃、200 r/min 恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵。將發(fā)酵培養(yǎng)基中按接種量4%接入種子液，32℃旋轉(zhuǎn)式搖床200 r/min，發(fā)酵72 h，即得到黃原膠發(fā)酵液，碳源的起始濃度一般以2%～4%為好。

1.3.3 純化黃原膠。發(fā)酵液中加入蛋白酶，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，使菌體進(jìn)行裂解，然后進(jìn)行過(guò)濾離心，使固液分離。再通過(guò)醇沉淀法沉淀分離，當(dāng)醇濃度為60%～70%時(shí)，會(huì)使黃原膠相互凝集，形成沉淀并與水分開，此時(shí)進(jìn)行黃原膠的提取分離。

1.4 誘變育種。將黃單胞菌菌株進(jìn)行平板涂布篩選，篩選出直徑最大的作為誘變育種的出發(fā)菌株。在紫外線照射的環(huán)境下，打開培養(yǎng)皿，設(shè)計(jì)照射時(shí)間分別為40 s、80 s 和120 s，設(shè)計(jì)紫外照射距離分別為20 cm、30 cm 和40 cm。

1.5 黃原膠的純化提取。通過(guò)對(duì)誘變結(jié)果觀察對(duì)比，淘汰生長(zhǎng)相對(duì)遲緩和菌落較小的黃單胞菌株，選取幾株生長(zhǎng)速度較快的菌株再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，得到發(fā)酵液，再通過(guò)提取黃原膠，并測(cè)定其黃原膠產(chǎn)量。取200 ml 發(fā)酵液置于離心管中，向發(fā)酵液中添加5 g 的CaCl2，在發(fā)酵液溫度65 ℃、pH 值5.5 的條件下添加蛋白酶1 萬(wàn)U，酶解3 h；在發(fā)酵液溫度40 ℃，pH值9.5 的條件下，添加溶菌酶1 萬(wàn)U 并維持6 h，酶解全部完成后滅酶醇提，稱量其干重。并與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行對(duì)比，得到高產(chǎn)的正突變菌株。相對(duì)提取率(%)=突變株黃原膠回收量/對(duì)照株黃原膠回收量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的獲得與培養(yǎng)。經(jīng)增殖和選擇培養(yǎng)分離到菌株，菌落形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果符合黃單胞菌屬特征。試驗(yàn)得到菌種生長(zhǎng)曲線(圖1)。由圖1 可看出，適合黃單胞菌的生長(zhǎng)溫度為20 ℃～35 ℃，40 ℃時(shí)黃單胞菌基本停止生長(zhǎng)，60 ℃為它的致死溫度。

圖1 發(fā)酵菌種的生長(zhǎng)曲線

2.2 誘變菌株的獲得。按設(shè)計(jì)的紫外照射時(shí)間和工作距離進(jìn)行誘變?cè)囼?yàn)，計(jì)算不同條件下的活菌數(shù)。與對(duì)照野生菌對(duì)比可計(jì)算得到致死率。不同誘變時(shí)間和誘變距離下的誘變效果如表1 和表2所示。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，致死率在70%左右時(shí)，紫外線誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生正突變的效果最好，選擇紫外照射時(shí)間為80s；在照射距離為40cm時(shí)，致死率最低，最終選擇照射的距離為40cm。

表1 不同誘變時(shí)間下的致死效果

表2 不同誘變距離下的致死效果

2.3 黃原膠的純化提取。利用平皿反應(yīng)選擇幾株突變菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，純化黃原膠產(chǎn)物，并計(jì)算相對(duì)提取率。通過(guò)試驗(yàn)獲得3 株高產(chǎn)菌株，相對(duì)提取率如表3所示。與對(duì)照株相比，相對(duì)提取率分別是155.6%、146.8%和142.5%。

表3 突變株發(fā)酵產(chǎn)物黃原膠的相對(duì)提取率

3 結(jié)論與討論

通過(guò)菌種的獲得與培養(yǎng)試驗(yàn)得出，適合黃單胞菌的生長(zhǎng)溫度為20 ℃～35 ℃，40 ℃時(shí)黃單胞菌基本停止生長(zhǎng)，60 ℃為它的致死溫度。通過(guò)紫外線照射誘變?cè)囼?yàn)得出，最佳紫外線的誘變條件是：照射時(shí)間80 s，照射距離40 cm。將突變菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，純化黃原膠產(chǎn)物，并計(jì)算相對(duì)提取率，與對(duì)照株相比，相對(duì)提取率分別是155.6%、146.8%和142.5%。

因?yàn)辄S原膠具有穩(wěn)定、增稠、乳化等作用，所以是目前效果比較好的生物膠。黃原膠以極有特色的理化性質(zhì)被廣泛地用于各種食品的加工生產(chǎn)中。黃原膠可以提高食品的質(zhì)量，可以使其保質(zhì)期變長(zhǎng)，并且還可以優(yōu)化感官特性。除此之外，黃原膠還具有熱量較低，且不被人體所消化的特點(diǎn)，可作為膳食纖維使用。綜上所述，黃原膠具有非常廣闊的應(yīng)用前景。