基于5-羥甲基糠醛和外觀色差判別新會陳皮的陳化方式研究

陳明權(quán)， 商雪瑩， 張懷， 何風(fēng)雷， 覃仁安

（廣州白云山陳李濟藥廠有限公司，廣東廣州 510288）

2020年版《中華人民共和國藥典》[1]規(guī)定陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種（如茶枝柑Citrus reticulate‘Chachi’等）的成熟果皮，主要有陳皮、廣陳皮2個品種，其中，廣陳皮（Citrus reticulate‘Chachi’）主產(chǎn)于廣東新會，新會陳皮最為道地[2]。中醫(yī)藥理論及歷代本草論述[3]中均認為陳皮“陳久者良”，是指陳皮需放置陳化后才能作為藥用，且陳化時間越久的陳皮藥效越好。廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)《DB44/T 604-2009地理標(biāo)志產(chǎn)品新會陳皮》定義“陳皮”為在自然陳化環(huán)境下保存時間3年或以上的茶枝柑皮[4]。

目前的陳皮市場中，對于高年份陳皮的追捧一直熱度不減，且陳化年份對陳皮的價格具有決定性的影響，不良商販為了追求高利潤采用各種“加速陳化工藝”對新皮進行加速處理，例如將新皮放入電烤箱、灑水濕悶或煮茶染色，以使新皮表皮顏色快速變深用以冒充高年份的陳皮售賣，也導(dǎo)致了“虛假陳化年份”的市場亂象。而對于陳皮年份的鑒定，國家沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，基本靠陳皮廠商自律和采購者的經(jīng)驗鑒別，“工藝皮”極大地混淆了陳皮市場。因此，建立鑒別自然陳化陳皮和人工加速陳化陳皮的方法對于維護陳皮市場的良好生態(tài)顯得尤為重要。

一方面，色澤是鑒定藥材最直觀的方式，也是陳皮陳化年份的重要判別標(biāo)志，但是通過肉眼區(qū)分色澤的方法缺乏客觀性，且不能進行有效推廣。鑒于此，本試驗引入色差分析儀[5]對藥材的色澤進行數(shù)據(jù)量化，可以對外觀色澤有更加客觀的表述。另一方面，大多數(shù)中藥在炮制或者儲存過程中，其色澤均有加深的跡象，絕大多數(shù)含有氨基酸及糖類成分的中藥，在加熱的條件下，會加速Maillard反應(yīng)[6]的進行。Maillard反應(yīng)又稱為非酶褐變反應(yīng)，是指羰基化合物（主要為還原糖類）與氨基化合物（如氨基酸、蛋白質(zhì)等）之間發(fā)生的反應(yīng)。反應(yīng)生成多種產(chǎn)物，5-羥甲基糠醛是Maillard反應(yīng)的經(jīng)典產(chǎn)物?，F(xiàn)代研究[7-10]表明百部、五味子、天冬、大棗等中藥材在儲藏過程中色澤加深均與5-羥甲基糠醛有直接的相關(guān)性，且何首烏[11]、山茱萸[12]、白術(shù)[13]在炮制后均產(chǎn)生了5-羥甲基糠醛，說明經(jīng)過高溫處理中藥材的5-羥甲基糠醛含量會增加，同時藥材色澤也會加深。

本研究以不同來源、不同陳化年份的多批次新會陳皮為研究對象，先建立測定內(nèi)在指標(biāo)5-羥甲基糠醛含量的高效液相色譜（HPLC）儀與QDa質(zhì)譜儀聯(lián)用方法，通過比較不同來源樣品中5-羥甲基糠醛的含量，以制定能有效判別“高溫加速陳化陳皮”的指標(biāo)限度。再利用色差儀對判別為“非高溫加速陳化陳皮”樣品的外觀色澤進行客觀數(shù)據(jù)量化。同樣，通過比較不同來源樣品中總色差值ΔE的大小，以制定能有效判別“煮茶染色加速陳皮”的指標(biāo)限度。最終根據(jù)5-羥甲基糠醛與ΔE的限度范圍，建立一種可靠、客觀的陳皮陳化方式的判別方法。同時，本研究可為中藥質(zhì)量評價方法的完善提供一種新的思路與方法。

1 材料

1.1 儀器NH310型三恩馳便攜式電腦色差儀（深圳市三恩馳科技有限公司）；Waters ACQUITY Arc-QDa高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀及Empower 3軟件處理器，X Select?HSS T3色譜柱（2.5μm，3.0×150 mm）（美國沃特世公司）；XPR 26/A百萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Sartorius BS110S萬分之一電子天平、TGL-15B離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Milli-Q Reference純水機（法國Millipore公司）；SB-5200 DT超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；WXJ型粉碎機（上海凱旋中藥機械制造有限公司）。

1.2 試劑5-羥甲基糠醛對照品（純度≥98%，中國廣州分析測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品，批號：19060403）；色譜級甲醇（德國Merck公司）；超純水、色譜級甲酸（純度>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.3 試驗樣品本研究的49個試驗樣品，分別為定向采購樣品（編號：D1~D15），市售樣品（編號：S16~S26），新會產(chǎn)區(qū)購置樣品（編號：C27~C30），基地采集自然陳化至今的樣品（編號：J31~J41、J45），以及自制加速陳化陳皮樣品（編號：W42~W44、W46~W48，R49），其中自制加速陳化陳皮樣品的處理方式：（1）將2007年11月采集的大紅皮（J41，自然陳化）分別制成不同的自制加速陳化樣品：①高溫110℃、高濕加速陳化（W42）；②高溫130℃加速陳化30 min（W43）；③高溫150℃加速陳化30 min（W44）。（2）將2007年10月采集的青皮（J45，自然陳化）制成不同的自制加速陳化樣品：①高溫110℃、高濕加速陳化（W46）；②高溫130℃加速陳化30 min（W47）；③高溫150℃加速陳化30 min（W48）。（3）將2003年當(dāng)年新皮用煮開的普洱茶水浸泡染色并晾干，自制成煮茶染色加速樣品（R49）。

以上樣品均經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室主任黃海波副教授鑒定為蕓香科植物茶枝柑Citrus reticulate‘Chachi’的果皮。樣品具體信息見表1。

表1 新會陳皮樣品信息表Table 1 Information of Xinhui Pericarpium CitriReticulatae samples

（續(xù)表1）

2 方法與結(jié)果

2.15-羥甲基糠醛含量測定

2.1.1 HPLC及質(zhì)譜條件 HPLC色譜條件：Waters X Select?HSS T3色譜柱（2.5μm，3.0 mm×150 mm）；以甲醇-0.1%甲酸水為流動相進行梯度洗脫，洗脫程序：2%~8%甲醇（0~12 min），8%~10%甲醇（12~20 min）；流速0.5 mL·min-1；柱溫35℃；進樣量：1μL。

質(zhì)譜條件：采用負離子模式。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置：采用電噴霧離子源（ESI源），離子源溫度（Probe）為600℃；正離子檢測，選擇性離子監(jiān)測（SIM）；毛細管電壓0.8 kV，錐孔電壓15 V，以質(zhì)荷比（m/z）127.04為測定離子（5-羥甲基糠醛）。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取對照品5-羥甲基糠醛20 mg，置于100 mL容量瓶中，加入10%甲醇充分溶解并稀釋至刻度線作為儲備液，儲存于4℃冰箱中。

2.1.3 供試品溶液的制備 取陳皮樣品粉末0.5 g（過65目篩），精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 10%甲醇，稱質(zhì)量，超聲處理45 min（功率300 W，頻率40 kHz）；放冷后稱質(zhì)量，用10%甲醇補足質(zhì)量；離心10 min（10 000 r·min-1，離心半徑3.5 cm），取上清，過0.22μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 專屬性考察 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和溶劑（10%甲醇，空白樣品）各1μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行測定，記錄色譜圖。樣品色譜圖與對照品色譜圖峰保留時間一致，且溶劑無干擾。色譜及質(zhì)譜圖分別見圖1、2。樣品色譜圖中出現(xiàn)與對照品色譜圖中保留時間（RT）一致的色譜峰（RT=10.11 min），無陳皮的陰性樣品對測定無干擾。

圖1 陳皮樣品、對照品及空白樣品離子通道色譜圖（m/z 127.04）Figure 1 Comparison of TIC chromatogram of Pericarpium CitriReticulatae samples，reference substances，and blank samples（m/z 127.04）

圖2 5-羥甲基糠醛質(zhì)譜圖Figure 2 Spectrum chromatogram of 5-hydroxymethylfurfura

2.1.5 線性關(guān)系考察 取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液依次稀釋并制成6個質(zhì)量濃度分別為25.00、6.26、1.56、0.39、0.09、0.04μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照“2.1.1”項下色譜-質(zhì)譜條件測定峰面積，以對照品濃度X（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得5-羥甲基糠醛回歸方程為Y=6.92×105X+4.60×105（r=0.999 8）。結(jié)果表明，5-羥甲基糠醛的進樣濃度在0.04~25.00μg·mL-1之間與峰面積值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液1μL，按照“2.1.1”項下色譜-質(zhì)譜條件連續(xù)進樣6次，測得5-羥甲基糠醛的峰面積積分值，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，5-羥甲基糠醛的RSD值為2.15%，表明儀器的精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一供試樣品（J31）6份，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜-質(zhì)譜條件進行檢測。測得5-羥甲基糠醛含量分別為0.023、0.024、0.023、0.025、0.021、0.024μg·g-1，計算RSD，結(jié)果顯示，其RSD值為4.60%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 定性試驗 取供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按照“2.1.1”項下色譜-質(zhì)譜條件進行測定，記錄峰面積，計算得5-羥甲基糠醛的RSD值為3.11%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收率 取已測定的陳皮樣品（D5）粉末0.50 g，精密稱定9份，分為3組，每組3份；分別加入5-羥甲基糠醛的0.5、1、1.5倍量對照品，按照上述供試品制備方法及色譜-質(zhì)譜條件進樣測定，測其峰面積，計算回收率。結(jié)果顯示，5-羥甲基糠醛平均回收率為96.30%，RSD值為2.77%（n=6）。結(jié)果見表2。

表2 5-羥甲基糠醛加樣回收結(jié)果Table 2 Sample recovery results of 5-hydroxymethylfurfura

2.1.10 含量測定 取不同來源陳皮樣品，分別按照“2.1.3”項下條件制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下條件測定含量，結(jié)果見表3、圖3。

從表3可知，不同來源陳皮的5-羥甲基糠醛含量存在明顯差異。自然陳化樣品（D、C、J）中的5-羥甲基糠醛含量介于0.003~0.213 mg·g-1之間，自制的高溫加速陳化樣品（W）的5-羥甲基糠醛含量（0.434~7.516 mg·g-1）均大于0.25 mg·g-1；而煮茶染色加速樣品（R49）的5-羥甲基糠醛含量僅為0.022 mg·g-1，遠低于高溫加速陳化樣品的。同時還可以發(fā)現(xiàn)，4個不同陳皮專營店購買的市售樣品（S）之間的5-羥甲基糠醛含量差異也較明顯，其中除了從“陳皮專營店3”購買的樣品（S22~S24）的5-羥甲基糠醛含量小于0.25 mg·g-1，其他市售樣品的含量均大于0.25 mg·g-1，特別是從“陳皮專營店2”購買的市售樣品（S18~S21）中5-羥甲基糠醛含量（0.257~1.133 mg·g-1），與自制的高溫加速陳化樣品（W）的含量范圍存在交集，說明市售樣品（S18~S21）可能經(jīng)過高溫加速處理。據(jù)此類推，市售樣品（S16~S17，S25~S26）也可能是經(jīng)過高溫加速處理的。

表3 不同來源陳皮中5-羥甲基糠醛含量測定結(jié)果Table 3 Results for the determination of 5-hydroxymethylfurfura content （n=2，mg·g-1）

結(jié)合圖3可知，當(dāng)5-羥甲基糠醛含量≥0.25 mg·g-1時，可以將高溫加速處理樣品與其他樣品區(qū)分開來。一方面，從“陳皮專營店3”購買的市售樣品（S22~S24）中的5-羥甲基糠醛含量范圍為0.014~0.114 mg·g-1，根據(jù)判別指標(biāo)5-羥甲基糠醛僅可推測市售樣品（S22~S24）未經(jīng)過高溫加速處理；另一方面，煮茶染色加速樣品（R49）的5-羥甲基糠醛含量（0.022 mg·g-1）在自然陳化樣品（D、C、J）5-羥甲基糠醛含量（0.003~0.213 mg·g-1）范圍內(nèi)，表明判別指標(biāo)5-羥甲基糠醛無法將“煮茶染色加速樣品”鑒別出來。

圖3 49種陳皮樣品5-羥甲基糠醛含量散點圖Figure 3 Scatter plot of 5-hydroxymethylfurfura content in 49 Pericarpium CitriReticulatae samples

以上結(jié)果表明，僅憑判別指標(biāo)5-羥甲基糠醛含量及限度，可以有效判斷出“高溫加速陳化陳皮”，而不能將“煮茶染色加速陳皮”鑒別出來，需要結(jié)合外觀色差等其他指標(biāo)進一步研究。

2.2 陳皮外觀色差測定

2.2.1 測定方法 采用國際照明委員會（CIE）認可的D65光源（相當(dāng)于自然日光，6 504 K），并進行黑白校正。陳皮樣品粉碎過65目篩，取約3.5 g，置于粉末測試盒（光距長1.0 cm），壓實，測定樣品的色度值為L*、a*、b*，按如下公式計算各樣品本身的總色度值ΔE[5]。

色度儀利用的是L*，a*，b*3個不同的坐標(biāo)軸，指示顏色在幾何坐標(biāo)圖中的位置及代號。a*和b*表示不同的色調(diào)方向。a*表示紅綠方向，+a*表示紅方向，-a*表示綠方向；b*表示黃藍方向，+b*表示黃方向，-b*表示藍方向；L*表示明度，L*越大亮度越高。以這3個數(shù)值計算的ΔE可以客觀地表示不同樣品的色澤能力，ΔE數(shù)值越大，其色澤越淺；反之，ΔE數(shù)值越小，其色澤越深。

2.2.2 測定結(jié)果 在陳皮樣品5-羥甲基糠醛含量測定結(jié)果的基礎(chǔ)上，針對除W、S16~S21，S25~S26等14個高溫加速處理樣品之外的35個陳皮樣品，采用色差儀測定其L*、a*、b*3個色度值，每個樣品重復(fù)測定3次，并計算總色度值ΔE。結(jié)果見表4、圖4。

圖4 35個陳皮樣品總色度值ΔE散點圖Figure 4 Scatter plot of totalchromaticity valueΔE in 35 Pericarpium CitriReticulatae samples

從表4可以看出，不同來源的同一陳化年份樣品的總色度值ΔE存在明顯的差異。其中，自然陳化樣品（D、C、J）的色差值ΔE介于68.74~88.21之間，而市售樣品（S22~S24）的ΔE值范圍為61.87~67.04，煮茶染色加速樣品（R49）的ΔE值67.56；三者之間的ΔE值并不存在交集。

表4 新會陳皮樣品總色度值ΔE測定結(jié)果Table 4 Results for the determination of total chromatic valueΔE of Pericarpium Citri Reticulatae samples（n=2）

一方面，按照新會陳皮陳化年份越久，其外觀色澤越深、色差值ΔE越小的變化趨勢；而市售樣品（S22~S24）的陳化年份（17~30年）低于自然陳化樣品（C30）的陳化年份（39年），其總色度值ΔE（61.87~67.04）卻小于自然陳化樣品C30（68.74）的，這不符合新會陳皮自然陳化的變化規(guī)律，表明市售樣品（S22~S24）的陳化方式不是自然陳化。另一方面，市售樣品（S22~S24）的ΔE值也均小于煮茶染色加速樣品（R49）的。由此可以推測，市售樣品（S22~S24）可能也經(jīng)過煮茶染色處理。

結(jié)合圖4可知，當(dāng)總色度值ΔE≤68時，可以有效判斷出“煮茶染色加速陳皮”；而自然陳化的陳皮樣品總色度值ΔE＞68。

以上結(jié)果表明，在一定的陳化年份范圍內(nèi)，以總色度值ΔE作為判別指標(biāo)，可以有效判斷出“煮茶染色加速陳皮”。

3 討論

根據(jù)廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)《DB44/T 604-2009地理標(biāo)志產(chǎn)品新會陳皮》規(guī)定，陳皮烘干時最高溫度不超過45℃，且2020年版《中華人民共和國藥典》中亦有規(guī)定陳皮應(yīng)曬干或低溫干燥而成。一方面，自然陳化的陳皮樣品不會經(jīng)過高溫處理，而人工加速陳化的陳皮一般會通過高溫、高濕處理，根據(jù)Maillard反應(yīng)的原理，高溫會導(dǎo)致其經(jīng)典產(chǎn)物5-羥甲基糠醛的含量顯著增加，因此，以5-羥甲基糠醛含量作為判別“高溫加速陳化陳皮”的指標(biāo)是科學(xué)的；另一方面，陳皮經(jīng)過煮茶染色處理后，其外觀色澤變黑，較同年份的自然陳化陳皮的色澤深，因此，以外觀色差值ΔE作為判別“煮茶染色加速陳皮”的指標(biāo)是可行的。

本研究以不同來源、不同陳化年份、不同處理方式等49批陳皮樣品為研究對象，首先根據(jù)陳皮高溫加速陳化會發(fā)生Maillard反應(yīng)的特點，建立了靈敏度高、重復(fù)性好的HPLC-QDa聯(lián)用測定5-羥甲基糠醛含量的方法，并制定了可以有效判別出“高溫加速陳化陳皮”的5-羥甲基糠醛含量限度（≥0.25 mg·g-1）。在此基礎(chǔ)上，引入色差分析儀對陳皮外觀色澤進行客觀的數(shù)據(jù)量化，分析非高溫加速樣品的總色度值ΔE變化范圍，制定了可以有效判別出“煮茶染色加速陳皮”的ΔE值限度（≤68）。由此可見，先后通過指標(biāo)5-羥甲基糠醛含量、總色度值ΔE的綜合判斷，可以有效鑒別出陳皮的陳化方式。

本研究首次提出以雙指標(biāo)5-羥甲基糠醛含量、ΔE判斷陳皮的陳化方式，并規(guī)定其限度。該雙指標(biāo)可以同時監(jiān)控陳皮外觀色澤與含量限度，可以客觀、準(zhǔn)確地判定陳皮陳化方式，同時可以為傳統(tǒng)陳皮陳化年份鑒定提供規(guī)范化的評價方法，對維護陳皮市場穩(wěn)定、健康發(fā)展具有重要的意義。

與制備前的樣品（J41、J45）相比，自制的高溫加速陳化樣品中5-羥甲基糠醛含量會隨著處理溫度的升高而增加。經(jīng)110、130、150℃高溫加速后，大紅皮加速樣品（W42~W44）中5-羥甲基糠醛的含量由加速陳化前的0.091 mg·g-1分別增加至0.476、1.819、7.516 mg·g-1，而青皮（W46~W48）中5-羥甲基糠醛的含量由加速陳化前的0.133 mg·g-1分別增加至0.434、0.858、3.196 mg·g-1，其5-羥甲基糠醛含量變化程度較大紅皮的小。從側(cè)面可以反映出，在相同加速條件下，大紅皮發(fā)生Maillard反應(yīng)的程度較青皮的快。究其原因，可能是大紅皮中多糖類物質(zhì)較青皮多[14-15]，而Maillard反應(yīng)以糖類為反應(yīng)底物，以致大紅皮在高溫加速Maillard反應(yīng)時得到的產(chǎn)物5-羥甲基糠醛比青皮的多，外觀色澤變得也較青皮的深。

以總色度值ΔE（≤68）作為判別指標(biāo)判別“煮茶染色加速陳皮”時，按照新會陳皮隨陳化年份越久，各相近年份陳皮之間的外觀色差值變化越小的規(guī)律，可以推測，該值的指標(biāo)限度也應(yīng)該適用于50年以內(nèi)的自然陳化陳皮。但該推斷是否可行，還有待以40~50年的自然陳化陳皮樣品作進一步驗證。