加減蒼附導(dǎo)痰湯治療多囊卵巢綜合征的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制

龍泳伶， 楊芳， 張瑤， 曾蕾， 盧如玲， 余璟瑋， 張如月

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405；3.廣州市番禺區(qū)何賢紀念醫(yī)院，廣東廣州 510000）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是一種多系統(tǒng)疾病，是世界范圍內(nèi)女性不孕的主要原因，其發(fā)病率為5%~10%，占不排卵性不孕的50%~70%[1]。多囊卵巢綜合征患者常伴隨高雄激素血癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗、雌激素升高、黃體生成素和卵泡刺激素比例失衡、不孕、肥胖以及其他健康問題，且其治療現(xiàn)狀非常不理想，嚴重影響婦女的身心健康。多囊卵巢綜合征的防治目前已成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題之一[2]。

多囊卵巢綜合征屬中醫(yī)學(xué)“月經(jīng)后期”“閉經(jīng)”“不孕”等病證的范疇。該病的中醫(yī)病因病機主要與腎虛、脾虛、血瘀、痰濕有關(guān)。胰島素抵抗發(fā)生的主要原因與內(nèi)臟脂肪堆積有關(guān)，應(yīng)屬“痰濕”范疇[3]。廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科張玉珍教授總結(jié)對多囊卵巢綜合征患者的臨床診治經(jīng)驗，認為多囊卵巢綜合征多屬痰濕內(nèi)阻型，治療當(dāng)以健脾化痰、補腎調(diào)經(jīng)為主要治法，擬定加減蒼附導(dǎo)痰湯治療多囊卵巢綜合征效果顯著[4]。蒼附導(dǎo)痰湯是化痰燥濕的經(jīng)方，但用于治療痰濕證月經(jīng)病時方中缺乏行血調(diào)經(jīng)之品，張玉珍教授在此基礎(chǔ)上以補腎健脾化痰、活血調(diào)經(jīng)立法，組方加減蒼附導(dǎo)痰湯，該方由蒼術(shù)、香附、法半夏、陳皮、茯苓、黃芪、石菖蒲、皂角刺、當(dāng)歸、丹參、淫羊藿等藥味組成[5]。多項臨床研究結(jié)果表明，加減蒼附導(dǎo)痰湯可減輕多囊卵巢綜合征患者的肥胖、超重情況，改善胰島素抵抗狀態(tài)，具有調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝的作用，并可調(diào)節(jié)性激素水平，改善受孕情況，提高妊娠率[6-8]。相關(guān)動物實驗結(jié)果表明，加減蒼附導(dǎo)痰湯能夠明顯改善多囊卵巢綜合征大鼠體質(zhì)量、胰島素抵抗及高雄激素狀態(tài)，可上調(diào)多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織及骨骼肌組織胰島素信號通路磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的活性，使蛋白PI3K/AKT相對表達量升高，對卵巢顆粒細胞也具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抑制凋亡等作用[9]。但加減蒼附導(dǎo)痰湯治療多囊卵巢綜合征的作用機制仍不甚清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)理論，建立在高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計算機虛擬計算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索基礎(chǔ)上實現(xiàn)新藥設(shè)計和藥物作用機制挖掘的學(xué)科，可揭示“藥物-靶點-疾病”相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，闡釋疾病的發(fā)生發(fā)展過程，從改善或恢復(fù)生物網(wǎng)絡(luò)平衡的整體觀角度認識藥物與機體的相互作用并指導(dǎo)新藥開發(fā)。因此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析加減蒼附導(dǎo)痰湯治療多囊卵巢綜合征的作用機制，以期為臨床應(yīng)用加減蒼附導(dǎo)痰湯治療多囊卵巢綜合征疾病提供更多的研究基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 加減蒼附導(dǎo)痰湯潛在活性成分的篩選及對應(yīng)靶蛋白的查找中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）是一個集中藥、化學(xué)制劑、靶標和藥物靶標網(wǎng)絡(luò)為一體的數(shù)據(jù)庫[10]。以11味組成中藥蒼術(shù)、香附、法半夏、陳皮、茯苓、黃芪、石菖蒲、皂角刺、當(dāng)歸、丹參、淫羊藿為關(guān)鍵詞，檢索加減蒼附導(dǎo)痰湯的化學(xué)成分。由于中藥的成分復(fù)雜多樣，且考慮到人體與藥物之間的相互作用，故需要對中藥成分進行條件篩選。類藥性（drug-likeness，DL）是被廣泛應(yīng)用于評價藥物先導(dǎo)化合物能否成藥的條件。因此，從數(shù)據(jù)庫中檢索化學(xué)成分的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性，選取同時滿足OB≥30%、DL≥0.18并去除無明確作用靶點的化學(xué)成分作為活性成分，進一步篩選加減蒼附導(dǎo)痰湯中11味中藥的潛在活性成分，再應(yīng)用UniProt數(shù)據(jù)庫查找其相應(yīng)的作用靶點。

1.2 多囊卵巢綜合征相關(guān)靶點的篩選GeneCards（https：//www.genecards.org/）是人類基因綜合數(shù)據(jù)庫，它提供簡明的基因組、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組、遺傳學(xué)和功能學(xué)上所有已知和預(yù)測的人類基因信息[11]。以“polycystic ovary syndrome”為關(guān)鍵詞搜集與多囊卵巢綜合征相關(guān)的蛋白。

1.3 加減蒼附導(dǎo)痰湯與多囊卵巢綜合征交集靶基因的篩選及其互作關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建利用R數(shù)據(jù)包VennDiagram 1.6.20對加減蒼附導(dǎo)痰湯潛在活性成分靶基因和多囊卵巢綜合征相關(guān)的靶基因制作韋恩圖，篩選交集基因。將交集基因輸入在線String 11.0數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），設(shè)置基因來源為人源，進行PPI分析，設(shè)置0.9置信度，隱藏游離的點，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。通過R語言包對從數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出的節(jié)點TSV.文件進行分析，篩選前10個核心調(diào)控基因靶點。

1.4 交集靶基因的基因本體論（GO）分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路分析利用R數(shù) 據(jù) 包colorspace（version 1.4-1）、stringi（version 1.5.3）、DOSE（version 0.9-17）、clusterProfiler（version 3.11）、pathview（version 4.0）將交集靶基因進行GO分析和KEGG信號通路分析，并用BMKCloud（http：//www.biocloud.net/）在線制圖軟件將其結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 加減蒼附導(dǎo)痰湯潛在活性成分的篩選以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件，篩選出潛在活性成分185個（除去重復(fù)的有159個），其中：蒼術(shù)9個、香附18個、法半夏13個、陳皮5個、茯苓15個、黃芪20個、石菖蒲4個、皂角刺11個、當(dāng)歸2個、丹參65個、淫羊藿23個。結(jié)果見圖1。

圖1 加減蒼附導(dǎo)痰湯活性成分示意圖Figure 1 Schematic diagram for active ingredients in modified Cangfu Daotan Decoction

2.2 加減蒼附導(dǎo)痰湯與多囊卵巢綜合征交集基因的篩選通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索出多囊卵巢綜合征相關(guān)靶點2 270個，與藥物活性成分靶點取交集后得到加減蒼附導(dǎo)痰湯治療多囊卵巢綜合征的預(yù)測靶點89個（去除組間重復(fù)基因），如圖2所示。其中，蒼術(shù)的交集基因有14個，香附的交集基因有73個，法半夏的交集基因有22個，陳皮的交集基因有25個，茯苓的交集基因有6個，黃芪的交集基因有67個，石菖蒲的交集基因有24個，皂角刺的交集基因有67個，當(dāng)歸的交集基因有7個，丹參的交集基因有39個，淫羊藿的交集基因有71個。

圖2 加減蒼附導(dǎo)痰湯-多囊卵巢綜合征靶點交集韋恩圖Figure 2 Venn diagram for intersection between modified Cangfu Daotan Decoction target genes and PCOS target genes

2.3 加減蒼附導(dǎo)痰湯與多囊卵巢綜合征靶標PPI核心網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將加減蒼附導(dǎo)痰湯與多囊卵巢綜合征交集的89個基因帶入String數(shù)據(jù)庫進行分析，結(jié)果見圖3。PPI結(jié)果包含89個節(jié)點，878條邊，平均節(jié)點的度值為19.7，局部聚類系數(shù)為0.588。點的連接線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大，PPI作用關(guān)聯(lián)度排名前10位的包括：白細胞介素（IL）-6、表皮生長因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、雌激素受體（ESR1）、原癌基因c-myc（MYC）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、細胞周期蛋白D1（CCND1）、原癌基因c-Fos（FOS）、酪氨酸激酶受體2（ERBB2）。

圖3 加減蒼附導(dǎo)痰湯治療多囊卵巢綜合征的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 PPI network of modified Cangfu Daotan Decoction treatment for PCOS

2.4 交集靶點的GO與KEGG可視化富集分析基于DAVID數(shù)據(jù)庫，將交集的89個關(guān)鍵基因做GO功能富集分析。GO分析結(jié)果顯示起主要作用的部分為分子功能（molecular function，MF），P<0.05的條目有83條，基因數(shù)目排名前3位的功能有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄催化劑活性、肽鏈結(jié)合、氨基化合物結(jié)合，結(jié)果見圖4。

圖4 加減蒼附導(dǎo)痰湯-多囊卵巢綜合征交集靶基因的GO分析（分子功能）氣泡圖Figure 4 Bubble diagram for Go analysis（molecular function）of intersection between modified Cangfu Daotan Decoction target genes and PCOS target genes

通過KEGG富集分析共篩選到97條信號通路，且富集到的所有信號通路的P值均小于0.05，排名前20條的通路主要涉及血液剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路、甲狀腺激素信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）信號通路、P53信號通路、內(nèi)分泌拮抗信號通路、催乳素信號通路、雌激素信號通路，和部分癌癥通路。結(jié)果見圖5。

圖5 加減蒼附導(dǎo)痰湯與多囊卵巢綜合征交集靶基因的KEGG信號通路（排名前20位）條形圖Figure 5 Bar diagram for top 20 KEGG signal pathways analysis of intersection between modified Cangfu Daotan Decoction target genes and PCOS target genes

3 討論

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)得到加減蒼附導(dǎo)痰湯185個活性成分，挖掘出136個預(yù)測靶點，與已知的2 270個多囊卵巢綜合征相關(guān)靶點取交集，最終獲得加減蒼附導(dǎo)痰湯治療多囊卵巢綜合征的89個靶點、878個可能存在的相互作用關(guān)系。

加減蒼附導(dǎo)痰湯治療多囊卵巢綜合征的關(guān)鍵作用靶點包括IL-6、EGFR、VEGFA、CASP3、ESR1、MYC、MAPK8、CCND1、FOS、ERBB2等。其中：IL-6是常見的炎癥反應(yīng)因子，已有研究證實，多囊卵巢綜合征小鼠模型卵巢組織中IL-6水平較正常對照組明顯升高[12]，也有研究表明IL-6水平的升高可刺激多囊卵巢綜合征大鼠脂肪細胞，激活A(yù)KT/STAT3信號通路，促進細胞增殖[13]。EGFR主要表達于顆粒細胞，臨床研究表明，EGFR在多囊卵巢綜合征患者卵巢組織中表達升高，可影響卵泡發(fā)育[14]。VEGF也被認為在多囊卵巢綜合征患者卵巢組織中高表達[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在接受輔助生殖技術(shù)手術(shù)的女性中，VEGF是控制卵巢血管生成的關(guān)鍵中介，能促進血管內(nèi)皮細胞分裂繁殖，增強毛細血管通透性，豐富血液供應(yīng)，激活胚胎著床[16]。已有研究證明，卵巢細胞凋亡可能介導(dǎo)卵泡閉鎖[17]，且卵巢顆粒細胞凋亡發(fā)生在卵母細胞凋亡之后[18]。CASP3是凋亡通路的核心功能蛋白，是IL-1β轉(zhuǎn)換酶家族的成員，同時也是多種凋亡途徑中常見的下游因子[19]。ESR1可影響子宮內(nèi)膜的容受性，與多囊卵巢綜合征女性早期流產(chǎn)有關(guān)[20]，其與多囊卵巢綜合征疾病和藥物靶基因均存在高度相關(guān)性[21]。MYC基因作為bHLH-LZ家族一員，常與Max結(jié)合形成二聚體嵌入常染色質(zhì)中[22]，作用于靶向DNA序列（CACGTG）調(diào)控眾多基因的轉(zhuǎn)錄，不僅能夠結(jié)合有活性的啟動子，還能夠結(jié)合活性增強子[23]，對涉及到細胞增殖、代謝、重編程和RNA生物合成的基因存在正/負調(diào)控作用[24]。CCND1作為G1期關(guān)鍵的調(diào)控蛋白，是研究細胞周期進程的主要指標，與其他細胞周期蛋白相比，其敏感性更高[25]。MAPK8是MAPK炎癥信號通路中的關(guān)鍵節(jié)點[26]。原癌基因FOS的異常低表達可導(dǎo)致多囊卵巢綜合征患者卵巢顆粒細胞雄激素分泌增加[27]。ERBB2屬于孤兒受體，尚無特異性配體，但同樣具有酪氨酸激酶活性，參與信號傳導(dǎo)系統(tǒng)和細胞生長的調(diào)節(jié)[28]。有研究表明，ERBB2在原始卵泡啟動生長中起重要的促進作用。亦有研究發(fā)現(xiàn)，在原始卵泡啟動生長過程中有ERBB2 mRNA的表達，且隨著卵泡發(fā)育逐漸增加[29]。經(jīng)分析，篩選出的關(guān)鍵靶點主要與細胞炎癥、增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程有關(guān)，故預(yù)測加減蒼附導(dǎo)痰湯可能通過調(diào)節(jié)上述靶點來減輕卵巢組織炎癥，調(diào)節(jié)卵巢細胞的生長發(fā)育及凋亡，進而發(fā)揮治療多囊卵巢綜合征的作用。

對加減蒼附導(dǎo)痰湯治療多囊卵巢綜合征相關(guān)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與生物GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄催化劑活性、肽鏈結(jié)合、氨基化合物結(jié)合是網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點的主要富集功能，提示加減蒼附導(dǎo)痰湯可能通過以上功能加快多囊卵巢綜合征的細胞和組織修復(fù)。

另外，關(guān)鍵交集靶點通路富集分析得到動脈粥樣硬化信號通路、甲狀腺激素信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、P53信號通路、內(nèi)分泌拮抗信號通路、催乳素信號通路、雌激素信號通路等同樣也具有重要的研究意義。動脈粥樣硬化的發(fā)生與多囊卵巢綜合征相關(guān)，通過對54名多囊卵巢綜合征婦女和60名年齡體質(zhì)量匹配的健康女性的對比研究發(fā)現(xiàn)，多囊卵巢綜合征本身不會增加該類人群罹患動脈粥樣硬化的風(fēng)險，但多囊卵巢綜合征伴隨肥胖會加重血脂對動脈粥樣硬化的危害作用[30]。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)的加減蒼附導(dǎo)痰湯可作用于多囊卵巢綜合征和動脈粥樣硬化疾病共同的致病靶點，值得進一步深入挖掘。多囊卵巢綜合征患者人群中，甲狀腺疾病的發(fā)病率顯著偏高，特別是甲狀腺功能減退比較常見。多囊卵巢綜合征患者存在生殖內(nèi)分泌紊亂，常合并代謝異常及甲狀腺功能異常，其各系統(tǒng)功能之間存在相關(guān)影響，常?；橐蚬P(guān)系錯綜復(fù)雜[31]。而本研究結(jié)果得出的交集靶點基因在甲狀腺素通路出現(xiàn)富集，提示加減蒼附導(dǎo)痰湯可能作用于該通路靶點以達到治療作用。糖尿病及其并發(fā)癥可導(dǎo)致女性下丘腦-垂體-卵巢軸受損，引起月經(jīng)異常及子宮、卵巢功能異常，還可導(dǎo)致不孕、妊娠期并發(fā)癥以及增加不良妊娠結(jié)局風(fēng)險等[32]。研究[33]表明，通過抑制AGEs/RAGE/核因子kappaB（NF-κB）信號通路，可以降低氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，減輕組織損傷，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。另外，AGEs通過RAGE、MAPK和NF-κB信號通路增加了多種組織細胞中脂鈣蛋白2（LCN-2）的表達，提示LCN2可能是改善胰島素抵抗的關(guān)鍵靶分子[34-35]。有研究顯示，LCN-2可通過胰島素刺激信號AKT，降低胰島素敏感性，誘發(fā)胰島素抵抗[36]。P53作為P53信號通路中的關(guān)鍵蛋白，為腫瘤抑制蛋白，可調(diào)節(jié)多種基因的表達，包括細胞凋亡、生長抑制，抑制細胞周期進程，分化和加速DNA修復(fù)，基因毒性和細胞應(yīng)激后的衰老。且已有研究表明，通過上調(diào)P53蛋白的表達可抑制自噬，從而改善多囊卵巢綜合征癥狀[37]。多囊卵巢綜合征是一種常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病，包括高雄激素血癥、高促黃體生成素血癥，雌激素1與雌激素2比例失調(diào)[38]。本研究結(jié)果得出的關(guān)鍵靶點在內(nèi)分泌拮抗通路上顯著富集，表明加減蒼附導(dǎo)痰湯可通過多靶點調(diào)節(jié)多囊卵巢綜合征患者內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)從而發(fā)揮治療作用。催乳素具有免疫抑制作用，可通過降低促炎細胞因子的表達，抑制細胞凋亡，減緩炎癥反應(yīng)和促進組織修復(fù)[39]。雌激素是一種類固醇激素，調(diào)節(jié)哺乳動物多種生理過程，包括生殖、心血管保護、骨完整性、細胞內(nèi)環(huán)境平衡等，雌激素通過原癌基因C-Mer受體激活Ca2+信號通路，影響下游轉(zhuǎn)錄因子一氧化氮合酶3（NOS3）降低機體胰島素敏感性[40-41]。

綜上所述，推測加減蒼附導(dǎo)痰湯治療多囊卵巢綜合征主要與細胞增殖、分化、凋亡、炎癥等生物學(xué)過程有關(guān)，可能通過抑制炎癥、凋亡，內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，組織穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等途徑發(fā)揮治療作用?；谏鲜龅难芯拷Y(jié)果，本課題組下一步擬開展加減蒼附導(dǎo)痰湯治療多囊卵巢綜合征的驗證實驗，以期為加減蒼附導(dǎo)痰湯治療多囊卵巢綜合征提供更多的依據(jù)。