六堡茶渥堆過程中產(chǎn)多酚氧化酶菌株的篩選及多酚氧化酶的分離純化

王 潔，何瑜琳，滕建文，夏 寧，韋保耀，黃 麗

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530000）

六堡茶是一種后發(fā)酵茶，其色澤表現(xiàn)為黑褐色，茶湯色紅濃明亮，滋味甘醇，香氣醇陳并具有獨特的檳榔香氣，其以“紅、濃、陳、醇”四絕著稱[1-2]。六堡茶是地理標(biāo)志產(chǎn)品，以其原料發(fā)現(xiàn)地——廣西省梧州市六堡鎮(zhèn)命名。六堡茶以蒼梧縣群體種、廣西大中葉種及其分離選育出來的品種、品系的茶樹鮮葉作為加工原料，茶葉中含有大量的茶多酚等活性成分。渥堆后的六堡茶具有豐富的次級代謝產(chǎn)物，如茶多酚、茶色素、茶多糖等活性成分，因此六堡茶具有降血糖、減肥、抗氧化等多種功能[3?5]。六堡茶的渥堆是微生物參與品質(zhì)形成的重要階段，在這一過程中由于微生物的加入，生化成分發(fā)生改變，對茶葉品質(zhì)的形成有極大影響。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是自然界分布極廣的一種氧化還原酶，能夠通過催化分子氧氧化酚或多酚形成對應(yīng)的醌。廣義上的多酚氧化酶包括酪氨酸酶（tyrosinase，EC.1.14.18.1）、兒茶酚酶（catechol oxidse，EC.1.10.3.1）和 漆 酶（laccase，EC.1.10.3.2）[6?8]，其廣泛存在于動物、植物、真菌及細(xì)菌中，其中，兒茶酚酶主要分布于植物中，微生物可產(chǎn)生的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。多酚氧化酶對于后發(fā)酵茶茶葉品質(zhì)形成的過程有舉足輕重的作用，因此研究六堡茶發(fā)酵階段產(chǎn)多酚氧化酶微生物的多樣性，對探索六堡茶品質(zhì)形成原因具有實際意義。在茶葉渥堆發(fā)酵過程中，多酚氧化酶首先作用于茶多酚，尤其是兒茶素等物質(zhì)，能夠使兒茶素氧化成醌，進一步氧化聚合而成茶黃素（TF）[9?12]與茶紅素（TR），TF與TR繼續(xù)與其他物質(zhì)進行氧化聚合，形成茶褐素（TB）[13]。而茶色素的存在會影響茶湯顏色及滋味。其中，TF與茶的澀味、亮度、顏色（黃色）及鮮爽味有密切關(guān)系；TR與茶的滋味、口感厚重度及顏色（紅棕色）有密切關(guān)系[14]。

本研究擬從渥堆六堡茶茶樣分離的微生物中，篩選產(chǎn)多酚氧化酶菌株，研究六堡茶渥堆階段可以產(chǎn)生PPO菌的微生物多樣性。并利用鹽析和透析初步純化PPO，再利用SDS-PAGE電泳并染色結(jié)合Native-PAGE電泳對酶進行活體染色從而判斷酶的分子量和酶的種類。PPO酶可以影響茶湯顏色和滋味，因此，了解產(chǎn)PPO酶的微生物種類，可以更好地了解六堡茶品質(zhì)形成的原因，同時對六堡茶新品的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

六堡茶渥堆茶樣 取自梧州市一家茶廠加工廠；兒茶素、葡萄糖、硫酸鎂、硝酸鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、胰蛋白胨、瓊脂、明膠、牛肉膏、酵母膏、牛肉粉、蛋白胨、植物蛋白胨、酵母浸粉、制霉菌素、氯化鈉、鄰苯二酚、氯四環(huán)素、硫酸銨 均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、牛血清蛋白 美國Sigma公司；引物27 F、1492 R、ITS1、ITS4、Gold view I染色劑 上海生工有限公司；細(xì)菌分離培養(yǎng)基 采用：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、肉液肉浸湯培養(yǎng)基、酵母膏胨葡萄糖（YPD）瓊脂培養(yǎng)基；真菌分離培養(yǎng)基

采用：馬鈴薯葡萄糖（PDA）瓊脂培養(yǎng)基、氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂培養(yǎng)基與DRBC培養(yǎng)基；真菌純化活化培養(yǎng)基 使用PDA；細(xì)菌純化活化培養(yǎng)基NA培養(yǎng)基。

G180TW高溫高壓滅菌鍋 美國ZEALWAY公司；ZQWY-200F振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；Power PacTMBasic電泳儀 伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司；SW-CJ-2FD型凈化工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV-1601PC紫外分光光度計日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種分離、純化及活化 菌種為課題組分離純化得到。分離方法簡述如下：用十字交叉法稱取磨碎后的茶樣25 g，加入含有225 mL的滅菌生理鹽水的錐形瓶中，用漩渦振蕩器振蕩25 min后，將得到的菌懸液按照10倍比例進行稀釋，直到稀釋至10?7，稀釋后的菌懸液備用。采用稀釋平板涂布法進行接種，用移液槍分別吸取0.1 mL的每個稀釋度的樣品菌懸液，均勻涂布于已經(jīng)配置好的平板培養(yǎng)基上。細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。其中，好氧細(xì)菌在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計數(shù)分離，厭氧細(xì)菌則是在37 ℃的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后分離計數(shù)。真菌培養(yǎng)基在28 ℃放置5 d，觀察生長狀況。待菌落長出后，根據(jù)菌落的生長特征進行分離純化。

菌種純化：挑出平板培養(yǎng)基上的單個菌落，用接種針將其接種于適合生長的培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，反復(fù)接種分離2~3次直至得到純的菌株，至恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記錄編號后于4 ℃保存。

菌種活化：取保存于4 ℃冰箱的培養(yǎng)平板，挑選單菌落在活化培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌于28 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)3~4 d，待用。

1.2.2 產(chǎn)多酚氧化酶菌株的初篩 細(xì)菌初篩培養(yǎng)基：兒茶素2 g，牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，加蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min；真菌初篩培養(yǎng)基：兒茶素2 g，葡萄糖30 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaNO33.0 g，KCl 0.5 g，K2HPO41.0 g，瓊脂20 g，加蒸餾水至1000 mL，121 ℃滅菌20 min。

初篩參考胡沛然[15]的方法并稍作修改。經(jīng)活化后的菌株，采用三點接種法點接于初篩培養(yǎng)基上。細(xì)菌與酵母培養(yǎng)48 h，霉菌培養(yǎng)4 d，并隨時觀察、記錄各個平板上菌落周圍產(chǎn)生褐色素的情況。周圍產(chǎn)生褐色素直徑和菌株直徑比（R）越大則表明多酚氧化酶的活力越大。取周圍產(chǎn)生褐色素直徑和菌株直徑比值大的微生物制備菌懸液。

1.2.3 產(chǎn)多酚氧化酶菌株的復(fù)篩 細(xì)菌菌懸液的制備：將初篩得到的細(xì)菌菌株用NA液體培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)24 h，活化2代，在4 ℃、8000 r/min條件下離心10 min；并用無菌生理鹽水洗滌2次，重懸，使菌懸液OD600nm值為0.8。

真菌孢子菌懸液的制備：將初篩得到的霉菌接種到PDA斜面上，在28 ℃下培養(yǎng)4 d后，加入無菌生理鹽水，刮落真菌菌落表面的孢子，為去除菌絲等雜質(zhì)，利用滅菌后的4層紗布過濾，用血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子濃度調(diào)整至106CFU/mL。

酵母菌懸液的制備：將初篩得到的酵母接種到PDA斜面上，用3 mL無菌生理水沖洗斜面, 在28 ℃，150 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)1 d，用血球計數(shù)板計數(shù)，濃度調(diào)整至106CFU/mL備用。

復(fù)篩液體培養(yǎng)基：曬青毛茶粉碎，稱取2 g，加水50 mL于250 mL三角瓶中，調(diào)pH6，110 ℃滅菌20 min，121 ℃滅菌20 min。

粗酶液制備及PPO活性測定：將菌懸液以3%接種量分別接種于復(fù)篩培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，250 mL錐形瓶中裝復(fù)篩培養(yǎng)基50 mL，細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)2 d；霉菌28 ℃培養(yǎng)4 d，酵母28 ℃培養(yǎng)3 d。取發(fā)酵液在4 ℃下10000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。酶活測定取磷酸緩沖液（pH7，0.2 mmol/L）2.85 mL，加入100 μL粗酶液，50 μL鄰苯二酚（60 mmol/L）。于420 nm處測吸光值，每隔30 s讀數(shù)一次，測量時間3 min。空白對照用50 μL磷酸緩沖液（pH7，0.2 mmol/L）代替50 μL的鄰苯二酚。以每分鐘A420變化0.01為一個酶活單位U 。

1.2.4 微生物的鑒定 將復(fù)篩后檢出有PPO酶活的微生物進行微生物分子鑒定。并選取多酚氧化酶酶活最大的一株微生物進行透析，SDS-PAGE電泳，Native-PAGE電泳和活性染色。微生物分子鑒定方法如下。

1.2.4.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)及生理生化 參照東秀珠，蔡妙英《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》。對細(xì)菌的形態(tài)進行觀察：觀察菌落顏色、大小、形態(tài)，并記錄菌落形態(tài)特征。

菌種的生理生化：革蘭氏染色發(fā)參考Hucker法[16]；明膠液化和吲哚試驗[17]；檸檬酸鹽試驗和糖、醇發(fā)酵試驗[18]。

1.2.4.2 DNA提取 在無菌操作臺，取50 μL滅菌的樹脂于無菌八連管中，用滅菌的牙簽挑取少部分上述活化的單菌落在裝有樹脂的八連管中研磨，金屬浴10 min后離心10 min取上清液制得模板DNA以備用。

另取一條八連管，制成25 μL體系。細(xì)菌擴增酶體系制備如下：將100 μL Mix酶，88 μL無菌水，4 μL引物27 F，4 μL引物1492 R混合均勻，均分為8份，每份混合液24.5 μL。真菌體系制備如下：將100 μL Mix酶，88 μL無菌水，4 μL引物ITS1，4 μL引物ITS4混合均勻，均分為8份，每份混合液24.5 μL。

1.2.4.3 PCR擴增 向擴增酶體系中加入0.5 μL上清液模板DNA。細(xì)菌PCR條件：95 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，31個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。?20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｕ婢鶳CR條件：95 ℃預(yù)變性8 min，94 ℃變性50 s，52 ℃退火45 s；72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.4 微生物鑒定 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠，在110 V，100 mA 在1×TAE電泳緩沖液中進行電泳，電泳時間為25 min，采用Gold view I染色劑進行染色，電泳結(jié)束后在凝膠成像儀上觀察PCR擴增條帶是否清晰完整。將PCR擴增產(chǎn)物送往上海美吉有限公司進行序列測定。并將測序后的結(jié)果在NCBI上用Blast軟件序列比對，選擇同源性較高的菌株，采用MEGA6.0進行進化樹的建立，確定所分離菌株的種屬。

1.2.5 菌株多酚氧化酶初步純化

1.2.5.1 試驗方法 取1.2.3制備好的100 mL粗酶液，磁力攪拌器攪拌，緩慢均勻加入硫酸銨，使其飽和度分別達到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%（W/V），均勻攪拌待沉淀充分后，10000 r/min，4 ℃下離心10 min，取離心后的少量上清液，測定殘余的酶活及蛋白質(zhì)含量，確定最佳的鹽析濃度。

1.2.5.2 蛋白質(zhì)含量測定 采用Brodford的考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。

1.2.5.3 多酚氧化酶初步純化 選擇合適的鹽析濃度后，在粗酶液中緩慢加入硫酸銨不停攪拌，至完全沉淀后，靜置得到鹽析溶液。鹽析液10000 r/min，4 ℃下離心15 min。去除上清液，取沉淀用磷酸緩沖液（pH7，0.1 mol/L）溶解，溶解后溶液再次在10000 r/min，4 ℃下離心15 min。收集上清液，在相同的磷酸緩沖液中透析（分子截留量3500 D）過夜，間隔一段時間更換透析液，用2% BaCl2溶液檢測硫酸銨，直到不再產(chǎn)生白色沉淀則為透析結(jié)束。透析后酶液在冰箱中4 ℃保存。

1.2.5.4 SDS-PAGE與Native-PAGE確定菌株P(guān)PO種類 SDS-PAGE參照LAEMMLI等[20]的方法，濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%。Native-PAGE參照VALIEV等[21]的方法，濃縮膠5%，分離膠10%，不加SDS，電泳后，對多酚氧化酶進行活性染色，N-二乙基對苯二胺（ADA）進行漆酶染色，對叔丁基鄰苯二酚（tBC）進行酪氨酸酶以及兒茶酚酶的染色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別采用Excel 2019、Origin 2019軟件分析和處理數(shù)據(jù)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。菌株的測序結(jié)果用BLAST（NCBI）軟件及MEGA 6.0（Sudhir Kumar）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)多酚氧化酶初篩

兒茶素在多酚氧化酶的作用下可生成黃紅色的氧化聚合物。產(chǎn)多酚氧化酶的菌株能氧化培養(yǎng)基中的兒茶素，生成顏色較深的氧化變色圈（圖1）。六堡茶渥堆過程中篩選得到的42株微生物中有4株細(xì)菌褐變明顯，分別為3、16、26、17號；6株霉菌褐變明顯，分別為1-6、2-9、2-11、2-13、2-3、1-7號，從中可以看出細(xì)菌產(chǎn)酶菌數(shù)量明顯少于霉菌產(chǎn)酶菌數(shù)量。初步判斷這10株菌有產(chǎn)多酚氧化酶的能力，選擇這10株菌進行復(fù)篩。

圖1 產(chǎn)褐色素菌株Fig.1 The strain of perspiration brown pigment

2.2 產(chǎn)多酚氧化酶菌株復(fù)篩

將10株初篩的產(chǎn)多酚氧化酶菌株進行產(chǎn)酶液體發(fā)酵，然后測定其產(chǎn)酶活性。不同菌株產(chǎn)酶活性結(jié)果見圖2。同時選擇這10株微生物進行分子學(xué)鑒定。由圖2可知，初篩選擇的菌株均能在液體培養(yǎng)時產(chǎn)生多酚氧化酶，其中，細(xì)菌的產(chǎn)酶能力整體上大于霉菌的產(chǎn)酶能力，細(xì)菌的產(chǎn)酶產(chǎn)量均超過20 U/mL。除了2-3號霉菌的產(chǎn)酶活力較大外其余產(chǎn)酶霉菌的產(chǎn)酶活力均小于15 U/mL。16號與2-3號菌株產(chǎn)酶量均超過35 U/mL。根據(jù)檢測的酶活數(shù)據(jù)，選擇16號菌株（酶活37 U/mL）進行下一步多酚氧化酶的初步分離純化。

圖2 菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中PPO活性Fig.2 PPO activity of the strains in the liquid fermentation medium

2.3 產(chǎn)多酚氧化酶菌株生理生化及分子鑒定

對細(xì)菌進行菌落觀察和生理生化實驗。菌落形態(tài)觀察如表1，生理生化結(jié)果見表2。同時對微生物DNA提取和PCR擴增后，對DNA進行純化、檢測。測序得到結(jié)果提交至Genbank，根據(jù)比對結(jié)果選取同源性較高的菌株利用MEGA 6軟件構(gòu)建進化樹。鑒定結(jié)果如表3，系統(tǒng)進化樹如圖3。

圖3 系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree

表1 發(fā)酵六堡茶中細(xì)菌的特征Table 1 Characteristics of bacteria in fermented Liupao tea

表2 六堡茶分離細(xì)菌的理化特性Table 2 Physiological characteristic of bacteria isolated from Liupao tea

表3 微生物分子鑒定結(jié)果Table 3 The results of microbial molecular identification

傳統(tǒng)發(fā)酵工藝的六堡茶中微生物來源廣，微生物種類多且雜。此次通過傳統(tǒng)分離純化和特異性選擇，從課題組內(nèi)的27株細(xì)菌、14株霉菌和1株酵母中篩選細(xì)菌4株3個屬，霉菌6株5個屬在六堡茶固態(tài)發(fā)酵階段中可以產(chǎn)生多酚氧化酶，分別為Erwinia oleae、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、成團泛菌（Pantoea vagans）、黑曲霉（Aspergillus nige）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、Penicillium brocae、灰黃青霉（Penicillium griseofulvum）、赤散囊菌（Eurotium rubrum）。其中，細(xì)菌的泛菌屬、真菌的曲霉屬和青霉屬都是黑茶發(fā)酵過程的優(yōu)勢微生物[22?23]。

有研究表明Klebsiella pneumoniae[24?25]、黑曲霉[26?28]、煙曲霉[13,29]可以產(chǎn)生多酚氧化酶，因此在六堡茶發(fā)酵階段，這些微生物可以通過分泌多酚氧化酶，進行酶促反應(yīng)氧化兒茶素為茶黃素和茶紅素，進而影響茶湯顏色和滋味[11]。而成團泛菌、赤散囊菌等微生物可以分泌多酚氧化酶未見詳細(xì)研究。本研究通過篩選產(chǎn)PPO微生物，可以初步推斷影響六堡茶茶湯顏色的微生物群落組成，這為進一步分析六堡茶品質(zhì)形成提供了理論依據(jù)。

2.4 確定蛋白酶鹽析濃度

通過不同濃度的硫酸銨溶液鹽析成團泛菌離心后的發(fā)酵液，鹽析結(jié)果如圖4。參考Brodford的考馬斯亮藍法按照Y=0.5151+8.385X（R2=0.9917）計算蛋白質(zhì)含量。從圖4可知，經(jīng)過不同飽和度的硫酸鹽沉淀后，上清液酶活從40%開始下降，當(dāng)鹽濃度達到70%時，酶活最低；上清液蛋白質(zhì)含量在鹽飽和度為10%至30%時逐漸增加，在飽和度為30%~50%逐漸下降。鹽濃度為40%時酶主要存在于上清液中，而蛋白質(zhì)含量有所下降，因此選擇鹽濃度為40%時除去酶液中的雜蛋白；鹽濃度為70%時，上清液中酶含量最低，蛋白質(zhì)含量較高，因此，選擇70%鹽濃度沉淀目標(biāo)蛋白。將鹽析所獲得目標(biāo)沉淀，用磷酸鹽溶解，透析（分子截留量3500 D）除鹽后，得到初步純化的酶液在4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

圖4 硫酸銨分級沉淀Fig.4 Ammonium sulfate fractional precipitation

2.5 酶液的SDS-PAGE以及Native-PAGE分析

成團泛菌液體發(fā)酵后經(jīng)過硫酸銨沉淀后，沉淀物用磷酸緩沖液（0.1 mol/L pH7）溶解后，透析后的酶液分別用于SDS-PAGE及Native-PAGE電泳。

由圖5a和圖5b可知，透析后的酶液，經(jīng)過SDS-PAGE電泳和Native-PAGE電泳，染色后均可以看到5條清晰的條帶，顯示漆酶分子量在16~48 kDa之間。5個蛋白條帶分子量分別為16、20、25、40和48 kDa，推測PPO樣品尚未完全純化。錢磊[30]、陳瓊?cè)A[31]等研究發(fā)現(xiàn)存在漆酶分子量約為40 kDa，而且漆酶分子量的測定存在10~20 kDa的差異，因此此次測定符合已有報道的漆酶分子量范圍。圖5c是N-N二乙基對苯二胺（ADA）溶液進行的漆酶活性染色圖，若被測酶不具有漆酶活性則無法染色，但圖中可以看到兩條清晰的條帶，這表明該酶是具有兩種不同構(gòu)型的漆酶。而圖5d為對叔丁基鄰苯二酚（tBC）溶液進行的兒茶酚酶及酪氨酸酶活性染色圖，在活性染色圖中，沒有發(fā)現(xiàn)條帶，表明成團泛菌所產(chǎn)PPO不具有兒茶酚酶和酪氨酸酶活性。由圖5可以初步判斷成團泛菌所產(chǎn)生的PPO酶是漆酶。漆酶可以作用于六堡茶中的木質(zhì)素[32]，還可以將酚類物質(zhì)氧化為醌類化合物或自由基等[33]。茶黃素的合成受漆酶的影響[34]。漆酶在30~50 ℃間活性較強，而六堡茶發(fā)酵時的堆溫約為45~50 ℃，這有利于漆酶作用。泛菌屬又作為六堡茶發(fā)酵過程的優(yōu)勢微生物[2]，對六堡茶茶色素的形成可能有極大的影響。

圖5 PPO酶的電泳圖和染色電泳圖Fig.5 Electropherogram and electropherogram stained of PPO

3 結(jié)論

本研究對渥堆六堡茶中分離得到的微生物進行了產(chǎn)多酚氧化酶的篩選，得到了10株產(chǎn)酶菌，其中包括4株3個屬的細(xì)菌和6株5個屬的霉菌，其中編號為16號菌株的成團泛菌產(chǎn)酶活性最高。這10株微生物中尚未報道可以產(chǎn)生多酚氧化酶的細(xì)菌為Erwinia oleae、成團泛菌（Pantoea vagans）和真菌Penicillium brocae、灰黃青霉（Penicillium griseofulvum）、赤散囊菌（Eurotium rubrum）。對16號菌株所產(chǎn)的多酚氧化酶進行了初步純化，選擇飽和度為40%的硫酸鹽去除雜蛋白，飽和度為70%的硫酸鹽溶液沉淀目標(biāo)蛋白。通過SDS-PAGE，Native-PAGE電泳和ADA漆酶染色，tBC兒茶酚酶和絡(luò)氨酸酶染色分析，判斷16號菌株所產(chǎn)的PPO酶屬于漆酶，分子量在16~48 kDa之間；本實驗證明了渥堆過程中存在產(chǎn)多酚氧化酶微生物，其中，微生物所產(chǎn)的漆酶可以作用于茶多酚生成茶黃素，從而影響六堡茶品質(zhì)的形成。本研究為六堡茶茶湯品質(zhì)的形成提供了一定的理論基礎(chǔ)，為今后研究微生物多酚氧化酶作用于茶葉酚類物質(zhì)的產(chǎn)物與茶葉品質(zhì)的關(guān)系做了鋪墊。