污泥好氧堆肥對PAHs的處理效果和抗生素及抗性基因消解效果

孫 偉， 匡 科， 嚴 興， 李碧清， 雷 芳， 王 雙， 肖先念

廣州市凈水有限公司， 廣東 廣州 510163

污泥資源化是目前城市污泥處理方式中應用較為廣泛的一種方式[1]. 污泥堆肥致力于N、P、K等營養(yǎng)元素的保留以及有機質的穩(wěn)定和腐熟，從而制備高肥效、低毒性的土壤改良劑[2]. 但污泥中也不可避免地含有病原菌、臭氣和難降解有機物等有害物質，特別是生化工藝不能完全降解的合成洗滌劑、化妝品等難降解有機物在污泥中大量富集，我國各地區(qū)城市污泥中PAHs總量都超過10 mg/kg，其中廣州市城市污泥中PAHs總量的平均值為33.1 mg/kg，二次污染風險較大[3-5]，研究證明，堆肥處理產(chǎn)生的高溫高熱可有效地殺滅其中病原菌和寄生蟲卵[6]，但不能完全去除污泥中的難降解有機物[7-8]. 難降解有機物分子量較大、沸點高、不易揮發(fā)，污染風險較大，且降解除去困難，易在土壤和農(nóng)作物體內(nèi)積累[9-10]. 隨著抗生素的廣泛使用，活性污泥已成為抗生素和抗性基因的重要富集位點，其未經(jīng)處理直接施用具有潛在的生態(tài)環(huán)境和人類健康風險[11-12]. 污泥堆肥可以消減城市污泥中的抗生素，并對抗性基因的傳播和擴散具有一定的控制效果[13-14].

目前對污泥堆肥中難降解有機污染物的研究尚處于摸索階段，研究也有待進一步深入，堆肥產(chǎn)品的土地利用還沒有完整的科學理論依據(jù)[15-16]. 污泥堆肥后必然會有抗生素和抗性基因的殘留[17-19]，其在施用于土壤過程中，殘留的抗生素是否會對土壤活性、微生物群落結構造成影響？殘留的抗生素抗性基因是否會發(fā)生水平遷移？這些都是污泥堆肥土地利用過程中亟需解決的問題. 因此，該研究通過污泥混合木屑、微生物發(fā)酵菌、生物質炭和蘑菇渣進行共堆肥研究，探討難降解有機物的降解去除以及抗生素和抗性基因的消解情況等，并進行了土壤改良試驗，以期為堆肥產(chǎn)品的應用提供有效的技術和理論支持.

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試驗裝置

城市污泥取自廣州市大坦沙污水處理廠，屬于典型的城市污水處理廠剩余污泥，從離心脫水機污泥出料口取樣，分別于06:00、10:00和14:00取等量樣品混合均勻；蘑菇渣、生物質炭、微生物發(fā)酵菌、木屑相關指標滿足堆肥要求，經(jīng)檢測，蘑菇渣和木屑中的PAHs含量極低，均低于檢出限，而試驗用的木屑取自森林，蘑菇渣經(jīng)過優(yōu)選，受抗生素影響較小，生物質炭和微生物發(fā)酵菌復配量少，可忽略其本底值[20]；堆肥裝置采用定制保溫不銹鋼罐，規(guī)格為直徑60 cm、高60 cm，內(nèi)置自動攪拌裝置，加蓋密封. 采用鼓風機曝氣，鼓風機風量控制在0.2 m3/h左右[20].

16種PAHs混合標準樣品1 mL (UREA-REPAH107，New Zealand)，包括苊(Ace)1 000 μg/mL、蒽(Ant)100 μg/mL、苯并蒽(BaA)100 μg/mL、熒蒽(Fluo)200 μg/mL、1,2-苯并菲(Chry)100 μg/mL、芴(Flu)200 μg/mL、萘(Nap)1 000 μg/mL、菲(Phe)100 μg/mL、芘(Pyr)100 μg/mL、苊烯(Acy)2 000 μg/mL、苯并[b]熒蒽(BbF)200 μg/mL、苯并[k]熒蒽(BkF)100 μg/mL、苯并[a]芘(BaP)100 μg/mL、茚并(1,2,3-cd)芘(IcdP)100 μg/mL、二苯并[a,h]蒽(DBA)200 μg/mL和苯并[g,h,i]芘(BghiP)200 μg/mL.

1.2 堆肥試驗

將木屑通過10目(相當于2 mm)的篩網(wǎng)，收集篩下的碎木屑，蘑菇渣切割成0.5 cm的碎片，生物質炭碾碎，通過0.2 cm的分子篩，按照不同的比例分別與蘑菇渣、酸性生物質炭和木屑混合進行堆肥試驗，堆體高50 cm，質量約100 kg，混合物料粒徑為0.05～5 cm，C/N為25∶1，含水率為78.5%. 根據(jù)前期研究成果[20]，最佳堆體的成分比例：污泥66.9%、微生物發(fā)酵菌0.1%、木屑20%、蘑菇渣8%和生物質炭5%，堆肥產(chǎn)品的粒徑集中在0.25～2 mm之間，占比為66.4%，有機質含量為50.5%，TN、TP和TK的含量分別達到3.88、0.64和1.10 g/kg，發(fā)芽指數(shù)為183%，各重金屬主要形態(tài)為殘渣態(tài)，Cr、Pb、Ni和Cu的含量分別為88.5、28.5、49.1和158.2 mg/kg.

1.3 土壤改良試驗

將堆肥產(chǎn)品用于城市建筑半硬化荒地，地上生長有人工種植的景觀喬木，荒地面積約 1 000 m2，土壤板結嚴重，含水率為8.5%，pH約為6.5，TN、TP和TK含量分別為0.05%、0.02%和0.30%. 將土壤改良劑混合肥料樣品(土壤改良劑50 kg，按照1∶3混入普通的農(nóng)田土壤)進行土壤改良試驗. 種植前，先將荒地整平，挖直徑30 cm、深30 cm的小坑，待植物種植后整平，每15 d再追加10 kg樣品. 改良3個月后，種植的海芋葉片飽滿，株徑2.5 cm，株高60 cm. 取改良的土壤進行檢測，含水率為22%～24%，pH為6.8，TN、TP和TK的含量分別為0.30%、0.25%和3.50%.

1.4 PAHs檢測分析

取50 g固體樣品，加入內(nèi)標PCB209，在20 ℃、100 Hz條件下超聲萃取3次，每次30 min，并加入10 mL HEX(正己烷)與DCM(二氯甲烷)(體積比為1∶1)的混合液，合并提取液，濃縮至2 mL. 制備好的樣品以氧化鋁、硅膠、無水硫酸鈉先后填充的凈化柱凈化，再以HEX與DCM的混合液洗滌凈化柱，接收洗脫液后濃縮定容至1 mL，待測.

樣品采用氣相色譜-質譜儀(7890A GC-5975BMSD，Agilent，美國)進行測定，使用HP-5M5柱(30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25 μm). 定量分析以選擇性離子監(jiān)測(SIM)模式進行. 進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為280 ℃，升溫程序：初始溫度為40 ℃，先以8 ℃/min的速率增至200 ℃，然后以8 ℃/min的速率升至300 ℃并保持10 min[21].

1.5 抗性基因檢測

對污泥(S1)、堆肥產(chǎn)品(S2)和土壤改良樣品(S3)抗性基因檢測. 采用分析數(shù)據(jù)評估及質控，對測序的原始數(shù)據(jù)通過FastQC進行質量評估，并通過Trimmomatic進行過濾處理，得到相對準確的有效數(shù)據(jù)；拼接組裝，使用IDBA_UD對各樣本Clean reads進行拼接組裝成長序列contig，根據(jù)reads間的overlap關系，獲得contig，并對多個Kmer的組裝結果進行綜合評定，選擇最佳Kmer組裝結果；采用Prodigal對拼接結果進行ORF預測，選擇長度大于等于100 bp的基因，并將其翻譯成氨基酸序列[22].

2 結果與討論

2.1 污泥堆肥試驗

根據(jù)前期研究成果[20]，堆體的最高溫度達到68 ℃，超過50 ℃的時間達到15 d(見圖1)，堆肥產(chǎn)品肥效好，堆肥產(chǎn)品的重金屬主要以較穩(wěn)定的殘渣態(tài)存在，不易在自然環(huán)境中溶解析出，發(fā)芽指數(shù)高.

圖1 污泥堆肥溫度變化情況

2.2 堆肥對PAHs的降解作用

PAHs溶解性較低、難降解，在污水處理過程中易被吸附到懸浮的固體顆粒上，從而在污泥顆粒上積累. PAHs具有致癌性，其含量是評估污泥農(nóng)用安全性的重要指標[23-24].

污泥和堆肥產(chǎn)品的PAHs檢測分析結果如圖2所示. 由圖2可見，污泥堆肥對PAHs的去除率基本都在50%以上，特別是芴、菲和蒽的去除率超過了80%. 統(tǒng)計分析顯示，堆肥前∑16PAHs(16種PAHs總量)為29.7 mg/kg，堆肥產(chǎn)品中∑16PAHs降至6.3 mg/kg，去除率達到78.7%，∑PAHs-cancer(具有致癌活性的4～6 環(huán)PAHs總量)從14.5 mg/kg降至3.8 mg/kg，去除率達到74.1%，∑PAHs-ppc(被我國列入環(huán)境“優(yōu)先污染物”的PAHs總量)從4.9 mg/kg降至1.5 mg/kg，去除率達到68.6%. 污泥堆肥對毒性最大的一種強烈致癌物——苯并[a]芘的去除率雖然只有65.4%，但剩余含量較低，僅為0.353 mg/kg. PAHs通過微生物體內(nèi)功能性酶的降解作用轉化為簡單的有機物中間體，從而被生物進一步利用，如真菌通過分泌單加氧酶將單個原子引入PAHs，產(chǎn)生環(huán)氧化物中間體，耦合水分子形成反式二醇和酚類；細菌類主要通過分泌雙加氧酶將兩個氧原子引入PAHs，產(chǎn)生二氧化物中間體，再進一步氧化成順式二醇，而后轉化為二輕基化合物，接著苯環(huán)斷開，并進一步代謝為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物. 一些環(huán)境微生物經(jīng)過適應和誘導可以對PAHs進行代謝分解，甚至礦化[25-26]. 堆肥對PAHs的降解率較高，但產(chǎn)品中的∑16PAHs仍超過GB 4284—2018《農(nóng)用污泥污染物控制標準》[27]A級污染物限值(5 mg/kg)和B級污染物限值(6 mg/kg).

圖2 污泥和堆肥產(chǎn)品中PAHs的含量及其去除率

選出堆肥產(chǎn)品中含量最高的4種PAHs——蒽、苯并蒽、1,2苯并菲和苯并[k]熒蒽，進行重復試驗和檢測分析，其隨時間的降解情況如圖3所示.

圖3 堆肥產(chǎn)品中含量最高的4種PAHs的降解情況

由圖3可見，在污泥堆肥前期，4種難降解PAHs的含量變化比較明顯，前8 d的其去除率均超過50%，這是因為各組分在堆肥過程中的降解主要取決于微生物的降解作用，溫度越高，微生物活性越強，PAHs的去除率也越高. 在堆肥進行到第12天時，上述組分含量基本趨于穩(wěn)定，到第16天時去除率基本維持不變，這是因為，在堆肥過程中PAHs的降解與污泥的腐殖化反應緊密相關，在污泥堆肥后期，污泥堆肥產(chǎn)品逐漸穩(wěn)定，微生物活性降低，去除率隨之降低.

分析結果顯示，PAHs的降解情況受苯環(huán)數(shù)量影響也較大，2～3環(huán)PAHs(如蒽)的降解速率較快，去除率較高；5～6環(huán)PAHs如苯并[k]熒蒽的降解速率相對較慢，去除率也不高. 這是因為，許多微生物(如假單胞菌屬、黃桿菌屬、諾卡氏菌屬等)能以環(huán)境中的低分子量(2～3環(huán))PAHs作為唯一的碳源和能源，并將其完全無機化，高分子量(4～6環(huán))PAHs的可溶性差，比較穩(wěn)定，難以降解，只有少數(shù)微生物(如白腐菌、煙管菌等)可以通過與其他有機質的共代謝等作用進行降解[7-8].

2.3 抗性基因消解效果分析

堆肥過程中共檢測出308種抗性基因，其中241種抗性基因的檢出率為100%. 在污泥(S1)中共檢出255種抗性基因，相對豐度范圍為0～67.8%；堆肥產(chǎn)品(S2)中共檢測出295種抗性基因，相對豐度范圍為0～71.8%；土壤改良樣品(S3)中共檢測出299種抗性基因，相對豐度范圍為0～70.2%(見圖4). 該結果表明，隨著堆肥時間的進行，抗性基因的種類呈輕微上升趨勢. 大環(huán)內(nèi)脂類和桿菌肽類抗性是檢測出的2種最主要的抗性基因，其中，大環(huán)內(nèi)脂類抗性基因種類在污泥樣品、堆肥產(chǎn)品和施肥土壤中分別占所有抗性基因種類的24.4%、25.7%和25.3%，表明堆肥對大環(huán)內(nèi)脂類抗性基因的消減效果并不明顯；桿菌肽類抗性基因種類分別占所有抗性基因種類的10.8%、9.6%和9.9%，說明桿菌肽類抗性基因種類在堆肥過程中呈現(xiàn)輕微下降趨勢，且施肥于土壤后出現(xiàn)遷移.BL2a_1(青霉素)、BL2b_rob(CP)、BL2e_y56(頭孢菌素)、BL3_cphA(CCCP)、FosA(磷霉素)、VanXD(VT)、dfrA24(甲氧下氨嘧啶)、catA16(氯霉素)、catA7(氯霉素)、catB5(氯霉素)及tetPA(四環(huán)素)等抗性基因在堆肥過程中被完全消減，消減率達到100%. 同時，136種抗性基因在堆肥過程中出現(xiàn)了不同程度的消減，其中，BL1_asba(頭孢霉菌素)、BL1_och(頭孢霉菌素)、BL1_pse(頭孢霉菌素)、BL2_veb(CP)、BL3_vim(CCCP)、EreA(紅霉素)、ErmO(LSM)、FosX(磷霉素)、MdtM(CAN)、QnrB(氟喹諾酮)、QnrS(氟喹諾酮)、SmeB(氟喹諾酮)、VanWB(萬古霉素)、VanWG(萬古霉素)、VatC(鏈陽性菌素)、VgbB(鏈陽性菌素)、catB4(氯霉素)、cmL_e8(氯霉素)及(四環(huán)素)這19種抗性基因在堆肥過程中的消減率超過85%. 抗性基因的消解是因為微生物在酸化水解和吸附降解的過程中，部分功能微生物出現(xiàn)衰亡，細胞裂解釋放的DNA與胞外DNA同時被水解或生物降解. 這一過程需要在特定的溫度、濕度和pH條件下，并通過微生物體內(nèi)功能性核酸酶的催化降解作用，觸發(fā)抗性基因的消解，DNA分子逐漸脫穩(wěn)，部分雙鏈分子結構逐漸轉變?yōu)閱捂湻肿咏Y構，同時，磷酸二酯鍵斷裂、氫鍵穩(wěn)定性降低、末端堿基脫落，抗性基因得到有效消解，這與已有研究結果[28-30]基本一致.

圖4 堆肥過程中群落結構變化

研究表明，微生物群落結構的變化是決定抗性基因多樣性的重要因素之一[31-32]，筆者通過對堆肥過程中微生物群落結構分析發(fā)現(xiàn)，Shannon-Wiener指數(shù)在堆肥過程中變化不明顯. 堆肥過程中門水平上的分析結果發(fā)現(xiàn)，污泥樣品被分為103個門類，其中變形桿菌門、放線桿菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、硝化螺旋菌門及厚壁菌門是其主要門類，分別占45.2%、19.0%、14.4%、8.5%、4.0%、1.8%及1.3%. 堆肥產(chǎn)品的微生物群落被分為102個門，其中放線桿菌門占比最大，達到42.8%，其次分別是變形桿菌門和擬桿菌門，分別占26.2%和21.5%. 施肥于土壤后微生物群落被分為104個門，其中放線桿菌門仍然占比最大，達到45.5%，其次是變形桿菌門和擬桿菌門，分別占26.9%和19.1%. 上述結果表明，堆肥及施肥過程中微生物群落在門水平結構上未發(fā)生明顯變化，這與Shannon-Wiener指數(shù)變化情況相對應，其次放線桿菌門含量在堆肥過程中呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢. 進一步分析堆肥過程中屬水平上微生物群落的變化，結果表明，污泥樣品中假單胞菌屬、分枝桿菌屬、酸桿菌屬、出芽菌屬及短根瘤菌屬是其主要的屬，分別占17.1%、15.3%、6.7%、5.4%及4.1%. 堆肥產(chǎn)品中分枝桿菌屬、黃桿菌屬、隱桿菌屬、棒狀桿屬和鞘氨醇桿菌屬轉變成為其主要的屬，分別占34.4%、3.7%、2.3%、2.0%和1.8%. 施肥土壤中分枝桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、中慢生根瘤菌屬及棒狀桿菌屬成為其主要菌屬，分別占32.9%、2.9%、2.5%、2.0%及1.8%. 該結果表明堆肥及施肥過程中微生物群落在屬水平上發(fā)生了較大變化，其中分枝桿菌屬和鞘氨醇桿菌屬的占比在堆肥過程中不斷增加，屬水平上微生物群落的變化可能與堆肥過程中抗生素類物質的降解有關[33-34].

3 結論

a) 添加輔料進行共堆肥，能夠促進污泥堆肥的腐熟，對PAHs的降解效果較好. 共堆肥能夠促進污泥中PAHs的降解，去除率基本都在50%以上，特別是芴、菲和蒽的去除率都超過了80%. ∑16PAHs的去除率達到78.7%，∑PAHs-cancer的去除率達到74.1%，∑PAHs-ppc的去除率達到68.6%. 但堆肥后∑16PAHs的總量為6.3 mg/kg，超過GB 4284—2018《農(nóng)用污泥污染物控制標準》A級污染物限值(5 mg/kg)和B級污染物限值(6 mg/kg)，且PAHs具有致畸性、致癌性和致突變性，在環(huán)境中難降解、易累積，PAHs經(jīng)過低等生物體的吸收、富集而產(chǎn)生的危害可以通過食物鏈進入人體. 因此，施肥土壤仍存在一定的生態(tài)風險，需要進行風險評估后施用.

b) PAHs的降解受溫度和持續(xù)高溫時間的影響較大，溫度越高，持續(xù)時間越長，PAHs的去除率也越高. PAHs各組分的降解與本身的結構亦相關，低分子量(2～3環(huán))PAHs的去除率較高，高分子量(4～6環(huán))PAHs的去除率相對較低.

c) 多種抗性基因在堆肥過程中出現(xiàn)了不同程度的消減，其中，BL2a_1(青霉素)、catB5(氯霉素)和tetPA(四環(huán)素)等11種抗性基因在堆肥過程中完全消減，消減率均達到100%，BL1_asba(頭孢霉菌素)、EreA(紅霉素)、QnrB(氟喹諾酮)和cmL_e8(氯霉素)等19種抗性基因在堆肥過程中消減率均超過85%，可見堆肥過程能有效消減該類抗性基因.

d) 堆肥過程中抗生素類物質的降解影響了屬水平上微生物群落的變化，其中分枝桿菌屬和鞘氨醇桿菌屬在堆肥過程中變化明顯，堆肥產(chǎn)品及施肥土壤中屬水平上微生物菌落的不確定性影響了污泥產(chǎn)品的農(nóng)業(yè)施用，有待進一步深入研究.