不同生育期轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤細(xì)菌群落特征

王甜甜， 閆 冰， 陳彥君， 關(guān) 瀟， 李俊生*

1.中國(guó)人民大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 北京 100872

2.江西省科學(xué)院能源研究所, 江西 南昌 330096

3.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院, 海南 海口 570228

4.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院, 國(guó)家環(huán)境保護(hù)區(qū)域生態(tài)過(guò)程與功能評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100012

轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉在棉花蟲(chóng)害預(yù)防中發(fā)揮重要作用，其大規(guī)模的商業(yè)化種植極大地提高了投入產(chǎn)出比，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益；與此同時(shí)，Bt蛋白在土壤中的釋放和持續(xù)殘留，也對(duì)自然和農(nóng)田產(chǎn)生了潛在生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[1-3]. 轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)作物根際分泌的Bt蛋白在土壤中的吸附和積累可能影響根際土壤微環(huán)境[4-5]，對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響[6]. 土壤微生物作為生物地球化學(xué)循環(huán)的重要驅(qū)動(dòng)者[7-8]，對(duì)土壤肥力、植物生長(zhǎng)與健康、有機(jī)物質(zhì)的周轉(zhuǎn)以及生態(tài)系統(tǒng)功能的維持等方面發(fā)揮重要作用，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要角色. 土壤微生物群落通常被認(rèn)為是反映土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的早期敏感指標(biāo)[9]，然而轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉對(duì)土壤微生物群落的潛在生態(tài)影響仍然知之甚少.

已有研究[10]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt基因作物對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響. 轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉可能會(huì)刺激細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致土壤微生物數(shù)量升高，改變土壤微生物群落組成，進(jìn)而增加土壤微生物群落多樣性[11]. 然而，有研究[12-13]認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物并未造成土壤微生物群落的顯著變化. Rui等[14]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉根際土壤可培養(yǎng)功能細(xì)菌數(shù)量?jī)H在棉花生長(zhǎng)期與親本對(duì)照之間呈顯著差異，且純化Bt蛋白添加試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除固氮菌外，其余功能細(xì)菌數(shù)量未受到Bt蛋白添加的顯著影響，即Bt蛋白不是導(dǎo)致根際土壤細(xì)菌數(shù)量減少的直接因素. 基于16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)研究轉(zhuǎn)Bt基因作物根際細(xì)菌群落的研究[15]表明，一些稀有菌門(mén)在根際微生物群落中占重要位置，其可調(diào)節(jié)植物營(yíng)養(yǎng)的吸收和土壤養(yǎng)分的循環(huán). 然而，作物不同生育期對(duì)養(yǎng)分吸收不同，不同生育期轉(zhuǎn)基因作物基因漂移發(fā)生的頻率存在差異，因此不同生育期轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉是否對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生影響仍存在不確定性，且其群落變化過(guò)程有待進(jìn)一步研究.

因此，該研究選取轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉作為研究對(duì)象，基于高通量測(cè)序技術(shù)分析了不同生育期土壤細(xì)菌群落的組成、結(jié)構(gòu)及多樣性差異，以揭示轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉不同生育期對(duì)土壤微生物群落的影響，并探討B(tài)t蛋白殘留對(duì)土壤微生物群落的驅(qū)動(dòng)過(guò)程，以期為轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉種植的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地區(qū)域概況

該研究在河北省邢臺(tái)市轉(zhuǎn)基因棉花種植示范基地(115.45°E、37.03°N)進(jìn)行,所在區(qū)域?qū)倥瘻貛啙駶?rùn)大陸性季風(fēng)氣候，四季分明，年內(nèi)溫差大. 夏季高溫多雨，冬季寒冷干燥，春、秋季短促，全年無(wú)霜期203 d，年均氣溫13.1 ℃，降水量476 mm. 降水季節(jié)分配不均勻，全年60%的降水集中在6—8月，土壤質(zhì)地為砂質(zhì)壤土. 試驗(yàn)地?zé)o轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及其對(duì)照的連續(xù)種植史.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與土壤樣品采集

該試驗(yàn)設(shè)置轉(zhuǎn)基因組和親本組，每組設(shè)置4個(gè)平行樣地，每個(gè)樣地面積為10 m×15 m，每個(gè)樣地之間設(shè)置20 cm寬的隔離帶，用于防止樣地間相互干擾. 試驗(yàn)分別于播種前期、苗期、吐絮期進(jìn)行根際土壤樣品采集，取樣時(shí)采用“抖根法”采集根際微生物樣品，采用五點(diǎn)法采樣混勻裝入無(wú)菌自封袋中用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃冰箱中保存待用.

1.3 研究方法

1.3.1土壤Bt蛋白殘留測(cè)定

基于美國(guó)Envirologix公司的ELISA試劑盒，測(cè)定土壤Bt蛋白殘留量，具體操作步驟根據(jù)操作說(shuō)明完成.

1.3.2DNA提取、PCR擴(kuò)增與高通量測(cè)序

土壤總DNA提取采用FastDNA?SPIN Kit for soil(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)試劑盒進(jìn)行，具體操作步驟根據(jù)操作說(shuō)明進(jìn)行；提取得到的樣品總DNA利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行定性檢測(cè)，經(jīng)SMA4000超微量分光光度計(jì)(Merinton, USA)測(cè)定其濃度、純度后，再將提取的總DNA分成3份放置于-80 ℃冰箱保存待用.

采用高通量測(cè)序研究土壤細(xì)菌群落組成；針對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V4區(qū)，使用通用引物515F (5′-GT GCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R (5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系為10×ExTaq buffer 4 μL、dNTPs 2 μL、BSA 0.2 μL、2.5 U Takara Ex Taq DNA聚合酶0.25 μL、引物各1 μL、DNA模板1 μL，滅菌超純水補(bǔ)足體系至25 μL. PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性溫度94 ℃ (2 min)；變性溫度94 ℃ (30 s)，退火溫度53 ℃ (30 s)，延伸溫度72 ℃ (45 s)，25次循環(huán)后72 ℃終止延伸10 min. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，使用E.Z.N.A.TM公司的Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，并用QuantiFluorTM-ST (Promega，USA)進(jìn)行定量分析后，構(gòu)建Miseq文庫(kù)，利用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)完成測(cè)序. 該研究測(cè)序工作委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成.

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

高通量原始測(cè)序數(shù)據(jù)的處理用Mothur v1.39.5 軟件參照Schlos等[16]標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行. 對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)分離、正反向序列拼接、分配樣品名稱(chēng)后進(jìn)行序列質(zhì)控，即去除測(cè)序過(guò)程中產(chǎn)生的低質(zhì)量序列；然后分析序列并且基于序列相似度(cutoff=97%)分成不同的可操作分類(lèi)單元(Operational taxonomic units, OTU)；采用RDP Classifier v2.2 (http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier)對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋?zhuān)J(rèn)置信度為0.7，比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)為Greengene 13.5 (http://greengenes.secondgenome.com). 通過(guò)Mothur v1.30.2 軟件計(jì)算alpha多樣性值(Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Sobs指數(shù)、PD指數(shù)). 使用FastTree v2.1.3 軟件根據(jù)最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，然后利用FastUniFrac分析得到樣本間距離矩陣.

對(duì)不同分組數(shù)據(jù)門(mén)水平相對(duì)豐度、多樣性指數(shù)進(jìn)行兩兩Student-t檢驗(yàn). 用主坐標(biāo)分析(Principal coordinates analysis, PCoA)(Bray-Curtis距離)比較根際土壤樣品間群落組成的beta多樣性差異，并用非參數(shù)多元方差分析(ADONIS)進(jìn)行差異檢驗(yàn). 采用Pearson相關(guān)分析探討土壤微生物門(mén)水平相對(duì)豐度及多樣性指數(shù)與Bt蛋白殘留的相關(guān)性. 該研究所有統(tǒng)計(jì)分析及制圖均基于R 3.5.1軟件不同程序包實(shí)現(xiàn).

2 結(jié)果與分析

24個(gè)根際土壤樣品的高通量測(cè)序序列經(jīng)過(guò)質(zhì)控過(guò)濾后，共有 2 002 553 條細(xì)菌16S rRNA基因高質(zhì)量序列. 其中，最少的樣品有 68 208 條序列，最多的樣品有 97 053 條序列，樣品平均序列條數(shù)為 83 440. 根據(jù)樣品中最小序列數(shù)，細(xì)菌每個(gè)樣品隨機(jī)挑選 68 208 條序列進(jìn)行樣品測(cè)序深度的均一化處理. 從根際土壤中共獲得 8 429 個(gè)OTU，細(xì)菌序列的平均樣品覆蓋率分別為98.5%，表明測(cè)序取樣深度幾乎涵蓋了大部分的根際土壤細(xì)菌.

2.1 不同生育期根際土壤微生物群落組成

所有細(xì)菌16S rRNA基因序列比對(duì)被分類(lèi)成47個(gè)門(mén)、106個(gè)綱和1 228個(gè)屬，有1.03%的序列在門(mén)水平不能進(jìn)行分類(lèi). 不同樣品細(xì)菌門(mén)水平(相對(duì)豐度>0.01)組成一致，分別為變形菌門(mén)(Proteobacteria，相對(duì)豐度為 0.433 8～0.499 3)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，相對(duì)豐度為 0.106 0～ 0.136 6)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria，相對(duì)豐度為 0.074 9～ 0.146 4)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes，相對(duì)豐度為 0.054 2～ 0.072 3)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria，相對(duì)豐度為 0.053 8～0.089 9)、疣薇菌門(mén)(Verrucomicrobia，相對(duì)豐度為 0.032 4～0.046 9)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes，相對(duì)豐度為 0.021 6～0.049 5)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria，相對(duì)豐度為 0.012 0～0.032 0)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi，相對(duì)豐度為 0.012 5～0.026 9)、浮霉?fàn)罹T(mén)(Planctomycetes，相對(duì)豐度為 0.013 0～0.018 2)，以及未鑒定出的菌門(mén)unclassified_k_norank_d_Bacteria和Patescibacteria (見(jiàn)圖1).

比較不同生育期轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及親本根際土壤的細(xì)菌群落組成(見(jiàn)圖2)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度在苗期、吐絮期均高于親本同期(P<0.05)，芽單胞菌門(mén)在苗期的相對(duì)豐度顯著低于親本(P<0.05)，放線(xiàn)菌門(mén)在吐絮期的相對(duì)豐度低于親本在苗期(P<0.05)，疣微菌門(mén)在吐絮期的相對(duì)豐度高于親本在播種前期 (P<0.05)，綠彎菌門(mén)在苗期的相對(duì)豐度顯著高于親本同期(P<0.05)，藍(lán)細(xì)菌門(mén)在苗期的相對(duì)豐度高于親本在播種前期. 比較轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及親本根際土壤細(xì)菌群落組成隨生育期的變化發(fā)現(xiàn)，親本根際土壤中變形桿菌門(mén)的相對(duì)豐度在吐絮期高于苗期(P<0.05)，芽單胞菌門(mén)的相對(duì)豐度在苗期低于播種前期(P<0.05)，酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度在吐絮期低于播種前期(P<0.05)，藍(lán)細(xì)菌門(mén)的相對(duì)豐度在苗期低于播種前期(P<0.05)；轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤中藍(lán)細(xì)菌門(mén)的相對(duì)豐度在吐絮期低于播種前期(P<0.05)，而變形桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)等菌門(mén)的相對(duì)豐度隨生育期變化不顯著. 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤中擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)等菌門(mén)的相對(duì)豐度在各時(shí)期與親本差異不明顯.

注: *表示P<0.05.

在屬水平，共有40.03%的總細(xì)菌序列可以進(jìn)行正確分類(lèi)，豐度最高的6個(gè)屬分別為擬桿菌門(mén)的鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas，占6.27%)、變形菌門(mén)的根瘤菌屬(Rhodanobacter，占4.80%)、放線(xiàn)菌門(mén)的Gaiellales屬(Gaiellales，占3.18%)、厚壁菌門(mén)的芽孢桿菌屬(Gemmatimonadaceae，占2.43%)、擬桿菌門(mén)的噬幾丁質(zhì)屬(Chitinophagaceae，占2.40%)和變形桿菌門(mén)的黃單胞菌屬(Xanthomonadaceae，占2.33%)(見(jiàn)圖3).

注: *表示P<0.05； ** 表示P<0.01.

根據(jù)所有樣品在屬水平的物種注釋?zhuān)x取相對(duì)豐度排名前35位的屬繪制成熱圖. 由圖3可見(jiàn)：吐絮期，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤中norank_f_Microscillaceae、norank_f_Longimicrobiaceae等屬含量均低于親本；苗期，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤中norank_o_Acidobacteriales等屬顯著高于親本，Chitinophaga屬顯著低于親本；播種前期，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及親本根際土壤細(xì)菌相對(duì)豐度前35位的屬差異不顯著.

2.2 不同生育期根際土壤細(xì)菌群落多樣性

轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉與親本在播種前期、苗期、吐絮期根際土壤細(xì)菌群落的alpha多樣性(Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Sobs指數(shù)、PD指數(shù))均無(wú)顯著差異(P>0.05)(見(jiàn)表1)；同時(shí)，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤細(xì)菌群落alpha多樣性在不同生育期也無(wú)顯著差異(P>0.05)(數(shù)據(jù)未列出). 這說(shuō)明相對(duì)于親本而言，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉對(duì)根際土壤細(xì)菌群落多樣性無(wú)顯著影響，并且不同生育期對(duì)根際土壤細(xì)菌群落的多樣性也無(wú)顯著影響.

表1 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及親本在不同生育期根際土壤細(xì)菌群落的alpha多樣性

利用主坐標(biāo)分析(PCoA)方法對(duì)不同生育期轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤細(xì)菌群落差異進(jìn)行分析(見(jiàn)圖4)，結(jié)果顯示不同生育期根際土壤樣品中細(xì)菌群落存在明顯的空間分異規(guī)律(ADONIS，P<0.05). 播種前期，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉和親本的土壤細(xì)菌群落無(wú)顯著差異(ADONIS，P=0.411)，說(shuō)明兩組樣地間土壤細(xì)菌群落相似；而苗期和吐絮期，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉和親本的土壤細(xì)菌群落呈顯著差異(ADONIS，P<0.05)，表明轉(zhuǎn)基因棉花的種植對(duì)土壤細(xì)菌群落產(chǎn)生顯著影響.

圖4 不同生育期轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及親本根際土壤細(xì)菌PCoA圖

2.3 根際土壤Bt蛋白殘留及其與菌門(mén)相對(duì)豐度之間的關(guān)系

為了進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉種植對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響，分析了轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及其親本在不同生育期根際土壤Bt蛋白殘留量及其與細(xì)菌門(mén)水平相對(duì)豐度的關(guān)系(見(jiàn)圖5、6). 親本根際土壤Bt蛋白本底值在不同生育期無(wú)顯著差異(P>0.05)，轉(zhuǎn)基因根際土壤Bt蛋白殘留量在不同生育期呈顯著差異(P<0.01)，且Bt蛋白殘留量在不同生育期呈播種前期<吐絮期<苗期的特征(見(jiàn)圖5). 不同生育期對(duì)比發(fā)現(xiàn)，播種前期轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉和親本Bt蛋白殘留量無(wú)顯著差異(P>0.05)，而苗期和吐絮期轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉和親本Bt蛋白殘留量均呈顯著差異(P<0.05).

注： ** 表示P<0.01.

對(duì)根際土壤Bt蛋白檢出量與門(mén)水平相對(duì)豐度之間進(jìn)行相關(guān)分析(見(jiàn)圖6)發(fā)現(xiàn)，根際土壤Bt蛋白殘留量與Acidobacteria、Armatimonadetes、Chloroflexi、GAL15、WPS-2的相對(duì)豐度均呈顯著正相關(guān)(R分別為0.706、0.569、0.515、0.44、0.413，P均小于0.05)，而與BRC1、Cyanobacteria、Gemmatimonadetes的相對(duì)豐度均呈顯著負(fù)相關(guān)(R分別為-0.423、-0.461、-0.406，P均小于0.05)；同時(shí)，相關(guān)分析(數(shù)據(jù)未列出)也發(fā)現(xiàn)，根際土壤Bt蛋白殘留量與差異菌屬gnorank_f_Microscillaceae、norank_f_Longimicrobiaceae的相對(duì)豐度均呈顯著性負(fù)相關(guān)(R分別為-0.531、-0.479，P均小于0.05)，而與norank_o_Acidobacteriales的相對(duì)豐度呈正相關(guān)(R=0.637，P=0.001).

注： 圖中灰色區(qū)域代表95%置信區(qū)間.

3 討論

不同生育期轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉和親本的根際土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)相同，均為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、疣薇菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、綠彎菌門(mén)和浮霉?fàn)罹T(mén)，對(duì)不同植物根際土壤微生物研究[17-19]也發(fā)現(xiàn)上述菌門(mén)是優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，表明植物根際土壤微生物優(yōu)勢(shì)菌門(mén)組成具有高度相似性，同時(shí)對(duì)棉花根際土壤細(xì)菌群落的研究[20]也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似結(jié)果. 因此，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉對(duì)根際土壤細(xì)菌門(mén)水平群落組成影響較小，這與Zhang等[21]研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因棉花和親本的生長(zhǎng)過(guò)程不會(huì)或很少引起根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類(lèi)群的變化. Dohrmann等[15]通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)研究轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤細(xì)菌群落發(fā)現(xiàn)，一些稀有菌門(mén)是根際微生物群落中重要的組成部分. Qiao等[20]研究發(fā)現(xiàn)：苗期Rhizoctonia、Alternaria受到促進(jìn)從而相對(duì)豐度升高，F(xiàn)usarium受到抑制從而相對(duì)豐度降低；蕾期Thanatephorus、Verticillium、Gibberella、Fusarium受到促進(jìn)從而相對(duì)豐度升高，Rhizoctonia受到抑制從而相對(duì)豐度降低. 然而，該研究對(duì)不同生育期根際土壤細(xì)菌相對(duì)豐度分析發(fā)現(xiàn)，棉花生育期對(duì)細(xì)菌門(mén)水平和屬水平相對(duì)豐度產(chǎn)生顯著影響，并且轉(zhuǎn)基因和親本間在苗期和吐絮期菌群的相對(duì)豐度存在顯著差異，這可能是由于轉(zhuǎn)基因棉花在不同生育期根際分泌物含量或組成不同所致，但仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證.

筆者研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及親本在各生育期，其根際土壤細(xì)菌群落alpha多樣性無(wú)顯著差異. 張永鑫[22]通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)玉米功能多樣性指數(shù)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在多個(gè)時(shí)期其土壤微生物群落的功能多樣性指數(shù)高于對(duì)照，認(rèn)為種植轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)玉米會(huì)增加土壤微生物多樣性. Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉秸稈還田30 d后，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉田土壤微生物群落的Shannon-Wiener和McIntosh指數(shù)均顯著高于非轉(zhuǎn)基因棉田，且微生物對(duì)土壤碳源的利用能力也顯著增加，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因棉花土壤微生物功能多樣性顯著高于親本. Yang等[24]研究也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉的種植使細(xì)菌和真菌多樣性增加. 然而，Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因棉花不同生育期會(huì)引起根際土壤微生物群落的大幅波動(dòng)，但轉(zhuǎn)基因和親本之間無(wú)顯著差異；陳彥君等[25]也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米種植對(duì)根際土壤細(xì)菌群落alpha多樣性無(wú)持續(xù)性影響. Zhou等[26]基于1個(gè)種植季節(jié)的研究也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因作物種植對(duì)根際土壤微生物群落多樣性無(wú)顯著影響. 綜上，轉(zhuǎn)基因作物種植對(duì)土壤微生物多樣性的影響仍存在不確定性，影響機(jī)制也不清楚，仍需要進(jìn)一步深入研究.

筆者研究發(fā)現(xiàn)，生育期對(duì)根際土壤微生物群落beta多樣性產(chǎn)生影響，并且苗期和吐絮期轉(zhuǎn)基因與親本根際土壤微生物群落也存在明顯差異，與Qiao等[20]研究結(jié)果一致. 已有研究[27-29]發(fā)現(xiàn)，根際微生物受到植物發(fā)育階段的顯著影響. Boudoin等[30]研究發(fā)現(xiàn)，植物生長(zhǎng)過(guò)程中根系分泌物的數(shù)量和質(zhì)量會(huì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致不同發(fā)育階段根際微生物群落組成的變化. 因此，推測(cè)轉(zhuǎn)基因植物與親本根際土壤微生物群落的時(shí)空分異可能是不同生育期植物根系分泌物變化所致，而苗期和吐絮期轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤Bt蛋白含量的差異也是重要原因之一. 值得注意的是，對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆根際細(xì)菌群落的研究[31]發(fā)現(xiàn)，對(duì)照和親本Beta多樣性在開(kāi)花期無(wú)顯著差異，但在營(yíng)養(yǎng)期和灌漿期均存在顯著差異；而轉(zhuǎn)基因玉米根際土壤細(xì)菌群落的Beta多樣性與對(duì)照相比，在抽穗期和開(kāi)花期均沒(méi)有顯著差異[32].

與親本相比，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉種植使根際土壤Bt蛋白殘留量顯著增加，且轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉不同生育期根際土壤Bt蛋白殘留量呈顯著累積現(xiàn)象，與陳彥君等[33]研究結(jié)果一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因作物種植導(dǎo)致土壤Bt蛋白殘留產(chǎn)生累積效應(yīng)[34-35]. Stotzky[36]認(rèn)為，完整的Cry1Ab蛋白與土壤顆粒結(jié)合可保持其殺蟲(chóng)特性，并在土壤中持續(xù)至少234 d. 筆者研究中相關(guān)分析表明，根際土壤Bt蛋白含量與細(xì)菌8個(gè)門(mén)的相對(duì)豐度均呈顯著相關(guān)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉對(duì)根際土壤細(xì)菌群落的影響可能是Bt蛋白殘留所致. 然而，Miethling-Graff等[37]基于長(zhǎng)期(3個(gè)生長(zhǎng)季)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，種植轉(zhuǎn)Bt基因玉米土壤中未發(fā)生Bt蛋白的積累，并且種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的土壤中也未檢測(cè)到Bt蛋白殘留累積[38]. 基于土壤微生物功能和碳循環(huán)研究[39]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期種植轉(zhuǎn)Bt基因水稻可能不會(huì)對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生顯著影響.

4 結(jié)論

a) 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及其不同生育期對(duì)根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)組成的影響不顯著，但對(duì)細(xì)菌菌門(mén)的相對(duì)豐度產(chǎn)生顯著影響(P<0.05). 不同生育期，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及其親本根際土壤變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、綠彎菌門(mén)的相對(duì)豐度存在顯著差異(P<0.05).

b) 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及親本在不同生育期對(duì)根際土壤細(xì)菌群落alpha多樣性無(wú)顯著影響(P>0.05)，但PCoA分析發(fā)現(xiàn)，苗期和吐絮期轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉和親本的土壤細(xì)菌群落均出現(xiàn)顯著空間分異(ADONIS，P<0.05).

c) 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉導(dǎo)致根際土壤Bt蛋白含量顯著增加(P<0.05)，且不同生育期存在顯著差異(P<0.05)，呈播種前期<吐絮期<苗期的特征.

d) 轉(zhuǎn)基因棉花根際土壤Bt蛋白殘留量導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落門(mén)水平相對(duì)豐度發(fā)生變化，其與酸桿菌門(mén)、裝甲菌門(mén)、綠彎菌門(mén)的相對(duì)豐度均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，而與藍(lán)細(xì)菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)的相對(duì)豐度均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05).