黃芪根腐病菌分離鑒定及細(xì)胞壁降解酶活性比較

沈煜鎧，李昭煜，李佳佳，田 天*

(1. 西安交通大學(xué) 勵(lì)志書院，西安 710049；2. 蘭州交通大學(xué) 甘肅省植物源生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

黃芪是多年生草本植物，其根入藥，具有較高藥用價(jià)值，現(xiàn)主要依賴人工種植.甘肅省渭源縣是甘肅黃芪的主產(chǎn)區(qū)之一，近年隨著輪作周期縮短以及連作面積增加使黃芪根腐病逐年加重[1-2]，渭源縣在多雨潮濕季節(jié)部分陰濕地區(qū)黃芪的發(fā)病率可達(dá)40%～60%[3].黃芪感病后輕者根部表皮粗糙，重者呈褐色腐朽狀，嚴(yán)重影響黃芪的品質(zhì)和產(chǎn)量.

鐮刀菌是一種重要的植物病原真菌，可引起根腐病等多種植物病害.鐮刀菌形態(tài)復(fù)雜，易受外界環(huán)境影響而發(fā)生變異，單憑形態(tài)學(xué)特征鑒定，常使鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確，從而影響后續(xù)研究工作[4].目前隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，一些基因位點(diǎn)如核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)、組蛋白( Histone 3)、β-微管蛋白(β-tubulin)、線粒體小亞基核糖體(mtSSU)、及翻譯延伸因子(EF-1α)等越來越多被用于鐮刀菌屬及種間的鑒定，彌補(bǔ)了形態(tài)學(xué)鑒定中的不足，其中rDNA-ITS和EF-1α基因應(yīng)用最多[5]，如李金花等[6]在對(duì)甘肅省馬鈴薯鐮刀菌干腐病優(yōu)勢(shì)病原進(jìn)行分子鑒定時(shí)就利用了EF-1α基因；高芬等[7]通過EF-1α基因序列對(duì)山西省蒙古黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)致病菌群進(jìn)行了分析；王喜剛等[8]在對(duì)寧夏回族自治區(qū)馬鈴薯鐮刀菌根腐病病原菌進(jìn)行鑒定時(shí)除了利用ITS基因序列還利用了EF-1α基因序列.

黃芪根腐病的主要致病菌是鐮刀菌屬真菌，駱得功等[9]調(diào)查了甘肅省定西市46 個(gè)點(diǎn)的大田和實(shí)驗(yàn)基地的黃芪根腐病并對(duì)采集的病樣進(jìn)行病原菌分離，通過形態(tài)學(xué)鑒定其主要致病菌是尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)；陳垣等[10]對(duì)甘肅渭源的黃芪根腐病菌分離鑒定結(jié)果表明尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌為主要致病菌，且前者致病力更強(qiáng)；趙慶芳等[11]的報(bào)道中的黃芪根腐病的病原菌為從隴西大田黃芪病株上分離純化所得茄腐鐮刀菌和尖鐮刀菌；牛世全等[12]對(duì)采集自甘肅省隴西縣的黃芪種植栽培地的根腐病株進(jìn)行病原菌分離，形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合rDNA-ITS序列分析得出優(yōu)勢(shì)致病菌為茄腐鐮刀菌和尖孢鐮刀菌.

細(xì)胞壁降解酶(cell wall degrading enzyme,CWDE)主要包括果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶和磷脂酶等[13]，能夠降解寄主植物的細(xì)胞壁從而有利于病原菌的侵入、定殖和擴(kuò)展，其中果膠酶、纖維素酶在病原菌致病過程中具有重要作用.鐮刀菌也能夠分泌多種細(xì)胞壁降解酶，且在侵染寄主植物的過程中不同鐮刀菌所分泌的酶的種類及活性均有區(qū)別，胡長志等[14]對(duì)蓮腐敗病菌(Fusariumoxyporumf.sp.nelumbicola)的5種細(xì)胞壁降解酶的酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明蓮腐敗病病菌在致病過程中起主要作用的細(xì)胞壁降解酶為多聚半乳糖醛酸酶和纖維素酶；董章勇等[15]對(duì)茄科作物致病尖孢鐮刀菌番茄?；?Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici,FOL)、辣椒?；?F.oxysporumf.sp.capsicum,FOC)和茄子?；?F.oxysproumf.sp.melongenae，F(xiàn)OM)3種鐮刀菌的5種細(xì)胞壁降解酶活性進(jìn)行比較，結(jié)果表明病原菌侵染的茄子和番茄體內(nèi)酶活性從高到低依次為 PG、PMG、PGTE、Cx和 PMTE，發(fā)病辣椒體內(nèi)酶活性從高到低依次為 PG、PGTE、PMG、PMTE和Cx；岳換弟等[16]對(duì)山西黃芪根腐病的的優(yōu)勢(shì)病原菌銳頂鐮刀菌(Fusariumacuminatum)、尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌產(chǎn)生得多聚半乳糖醛酸酶等6種CWDEs的酶活性進(jìn)行了比較，結(jié)果表明3種病原菌產(chǎn)生各種酶的活性大小和變化趨勢(shì)具有明顯差異，并得出病原菌產(chǎn)酶活性的大小在一定程度上能夠表明其致病力的大小的結(jié)論.

本文從甘肅渭源縣采集黃芪根腐病樣，對(duì)分離得到的病原菌除了形態(tài)學(xué)鑒定還利用rDNA-ITS和EF-1α基因序列分析進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)6株病原菌的致病力、生長速率及產(chǎn)孢量進(jìn)行測(cè)定，最后比較了6株病原菌產(chǎn)內(nèi)切1,4-β-D葡聚糖酶(Cx)、β-葡萄糖苷酶(βG)多聚半乳糖醛酸酶(PG)、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶 (PGTE)、果膠甲基反式消除酶(PMTE)及果膠甲基脂酶(PME)的活性，從產(chǎn)細(xì)胞壁降解酶的種類及酶活力的差異的角度對(duì)其致病力差異進(jìn)行分析，以期明確目前甘肅渭源地區(qū)黃芪根腐病病原菌種類及致病力分化情況，后續(xù)對(duì)強(qiáng)致病力菌株進(jìn)行防治試驗(yàn)研究.

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌：分離自甘肅渭源半陰坡村具典型黃芪根腐病狀的病株.

供試黃芪品種：蒙古黃芪.

試劑及儀器：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) Marker(100～2 000 bp) ，生工生物工程(上海)股份有限公司；Taq PCR Mix預(yù)混液(2X,含藍(lán)染料)，生工生物工程(上海)股份有限公司；光學(xué)顯微鏡，寧波永新光學(xué)股份有限公司；智能型生化培養(yǎng)箱，上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PCR儀，美國Bio-Rad公司.

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離鑒定

病原菌的分離采用組織分離法，并通過單孢純化得到純培養(yǎng).根據(jù)柯赫氏法則對(duì)病原菌的致病性進(jìn)行驗(yàn)證：將活化好的菌株制成8 mm的菌餅置于75%乙醇消毒且針刺處理的黃芪根段上，于25 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，待發(fā)病后，將發(fā)病部位再次分離培養(yǎng)，確定再次分離到的菌株與所接種的菌株為同株.具致病性的病原菌株于4 ℃保存.

將病原菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后觀察菌落的形態(tài)特征，并挑取少量菌絲置于光學(xué)顯微鏡下觀察病菌的菌絲和分生孢子的形態(tài)特征，初步進(jìn)行形態(tài)鑒定.將分離得到的病原菌株活化培養(yǎng)，于菌落邊緣挑取適量菌絲體進(jìn)行PCR，用rDNA-ITS和EF-1α兩組基因?qū)Σ≡M(jìn)行鑒定.rDNA-ITS基因的引物為ITSl 和ITS4，其序列分別為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，EF-1α基因的引物為EF-1和EF-2，其序列分別為5’-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3′和5′-GGAAGTACCAGTAATCATGTT-3’.PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括有：PCRmix12.5 μL，ddH2O10.5 μL，0.5 μL 5 μmol/L的ITS1/ EF-1和0.5 μL 5 μmol/L ITS4/ EF-2，適量菌絲.以上試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司.PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 4 min；變性94 ℃ 30 s；退火54 ℃ 45 s ；延伸72 ℃ 60 s；最后延伸72 ℃ 7 min，保持4 ℃.PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，通過軟件MEGA6.0使用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以明確系統(tǒng)發(fā)育學(xué)定位.

1.2.2 致病力測(cè)定

選取健康且粗細(xì)均勻的兩年生蒙古黃芪根部截成6 cm左右的根段，沖洗干凈，用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，每根段分別于上、中及下部3處均針刺5個(gè)傷口，將活化好的菌株用打孔器制成8 mm的菌餅朝下接種于針刺傷口上，每個(gè)菌株接種2個(gè)根段，25 ℃保濕培養(yǎng)3 d后取掉菌餅，接著培養(yǎng)至7 d后觀察發(fā)病情況并用十字交叉法測(cè)量病斑直徑.

1.2.3 菌絲生長速率測(cè)定

將6株病原菌株于25 ℃條件下培養(yǎng)7 d后用打孔器制成8 mm的菌餅，接種于PDA平板上，于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)，每個(gè)菌株3次重復(fù)，分別于第3 d、5 d、7 d、9 d用十字交叉法測(cè)量菌落直徑.

1.2.4 產(chǎn)孢量測(cè)定

將6株病原菌株制成8 mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，每處理3次重復(fù)，25 ℃恒溫培養(yǎng)10 d后用50 mL無菌水少量多次洗下孢子，用血球計(jì)數(shù)板分別統(tǒng)計(jì)大孢子和小孢子的濃度以計(jì)算毎皿的產(chǎn)孢量，同時(shí)于顯微鏡下測(cè)量大孢子和小孢子的大小.

1.2.5 粗酶液提取

CWDEs的誘導(dǎo)培養(yǎng)，將25 ℃條件下培養(yǎng)7 d的6株病原菌株用打孔器制成8 mm的菌餅并分別接種于100 mL PD培養(yǎng)基中，每瓶接5個(gè)菌餅，25 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)6 d，以作為種子液備用.誘導(dǎo)培養(yǎng)基選取改良后的Czaper液體培養(yǎng)基，誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生果膠酶加入誘導(dǎo)物果膠，誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生纖維素酶加入誘導(dǎo)物羥甲基纖維素鈉[18].將6株病原菌株的孢子懸浮液分別取1 mL接種于裝有100 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶中，每個(gè)菌株3次重復(fù)，于25 ℃，180 r/min條件下震蕩培養(yǎng).分別在第3、5、7、9、11 d取樣，每次取樣10 mL，分別用4層紗布濾除樣品中的菌絲，并以10 000 r/min在4 ℃條件下離心得粗酶液，4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.6 纖維素酶活力測(cè)定

通過DNS法測(cè)定纖維素酶CX和βG的活性[16].取2支試管分別標(biāo)記為1、2號(hào)，均加入1 mL 0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液(pH 5.0)和1mL 1%的底物溶液(βG的底物是水楊苷，CX的底物是羥甲基纖維素鈉)，50 ℃水浴5 min，1號(hào)管中加入1 mL粗酶液后直接加入2 mL DNS試劑，并立刻置于沸水中5 min以終止反應(yīng)，2號(hào)管中加入1 mL粗酶液，于50 ℃水浴酶解1 h后再加2 mL的DNS試劑，然后在沸水中反應(yīng)5 min以終止反應(yīng)，最終在OD540 nm處測(cè)定吸光值.

1.2.7 果膠酶活力測(cè)定

DNS比色法測(cè)定果膠酶PG和PMG的活性[16].取2支試管分別標(biāo)記為1、2號(hào)，均加入1 mL檸檬酸緩沖液(0.05 mol/L，pH 5.0)和1 mL 0.1%底物溶液(PG的底物是多聚半乳糖醛酸，PMG的底物是果膠)，50 ℃水浴5 min，1號(hào)管中加0.1 mL的粗酶液，然后直接加入2 mL DNS試劑并立刻置于沸水中5 min以終止反應(yīng)，2號(hào)管中加入1 mL粗酶液，于50 ℃水浴酶解1 h后再加入2 ml DNS試劑，然后沸水中反應(yīng)5 min以終止反應(yīng)，最終在OD540 nm處測(cè)定吸光值.

使用紫外分光光度法測(cè)定PMTE和PGTE的活性[16].取1 mL酶液并加入1 mL的0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.0)和1 mL 1%底物(PMTE的底物為果膠，PGTE的底物為多聚半乳糖醛酸)，接著加入1 mL CaCl2溶液(3 mmol/L)，然后置于30 ℃水浴10 min，最后取在OD232 nm處測(cè)定反應(yīng)前后的吸光值.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 13.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用鄧肯氏新復(fù)極差法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果分析

2.1 病原菌的分離鑒定結(jié)果

本試驗(yàn)共分離得到6株黃芪根腐病原菌，分別編號(hào)為GF1、GF2、GF3、GF4、GF5、GF6.在25 ℃條件下PDA平板上培養(yǎng)9 d 菌株GF5未能長滿平板，菌株GF1、GF2、GF3、GF4、GF6均能長滿平板，6株菌的株菌絲均較稀疏且為白色(見圖1(a)).培養(yǎng)15 d的菌落性狀有明顯區(qū)別，菌株GF1與GF5的菌落呈現(xiàn)暗紅色，菌株GF1還可見明顯的輪紋；菌株GF2 、GF6、GF4、GF3的菌落均呈現(xiàn)不同程度的暗綠色，且顏色依次由淺到深，均明顯可見墨綠色的分生孢子堆(見圖1(b)).正是由于這6株菌株的菌落特征差異較大，本文就進(jìn)一步對(duì)其致病力進(jìn)行了比較.

圖1 6株黃芪根腐病菌培養(yǎng)9 d和15 d的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of 6 pathogenic fungi cultured for 9 and 15 days

顯微觀察結(jié)果表明：6個(gè)菌株均能產(chǎn)生鐮刀狀的大型分生孢子和橢圓形的小型分生孢子，大型分生孢子均有2～4個(gè)隔，小型分生孢子無隔，從形態(tài)特征可以確定6株病原菌均為鐮刀菌屬真菌(見圖2).

圖2 菌株GF1、GF2、GF3、GF4 、GF5和GF6的分生孢子Fig.2 Conidia of GF1、GF2、GF3、GF4 、GF5 and GF6 strain

將菌絲擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明rDNA-ITS和EF-1α基因序列都在500～750 bp之間，經(jīng)測(cè)序所得菌株GF1、GF2、GF4、GF5、GF6的rDNA-ITS序列堿基長分別為569、569 、565、568、555、566 bp，EF-1α序列堿基長分別為715、711、711、712、698、716 bp.rDNA-ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明菌株GF1、GF2、GF4與MF077247(F.solani)、MF077246(F.solani)聚在一起，病原菌GF3、GF5與EU263916.1(F.solani)聚在一起，菌株GF6與MG561938.1(F.solani)聚在統(tǒng)一分支(見圖3(a)).EF-1α基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明菌株GF1、GF4、GF5與MG857483(F.solani)、MG857376(F.solani)聚于同一分支，菌株GF2、GF3與MH595519(F.solani)聚于同一分支，菌株GF6與MK560265(F.solani)、MK503785(F.solani)聚在一起(見圖3(b)).綜合兩組基因序列分析結(jié)果表明6株病原菌均為茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani).

圖3 基于rDNA-ITS和EF-1α序列采用鄰接法構(gòu)建菌株GF1-GF6及相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain GF1-GF6 and its related strains constructed by using neighbor-joining method based on rDNA-ITS and EF-1α sequences

2.2 菌絲生長速率測(cè)定結(jié)果

6株病原菌中菌株 GF3的生長最快，培養(yǎng)9 d后的菌落直徑為8.50 cm，長滿平板(見圖1)，菌株GF1、GF2、GF4、GF5及GF6培養(yǎng)9 d的菌落直徑分別為6.38、8.2、8.5、8.23、6.5和7.93 cm、(見表1)，菌株GF3培養(yǎng)9 d的菌落直徑與菌株GF1、GF5、GF6的菌落直徑差異顯著.

表1 6株黃芪根腐病菌的生長速率Tab.1 Growth rates of 6 strains of astragalus membranaceus root rot

2.3 產(chǎn)孢量測(cè)定結(jié)果

培養(yǎng)10 d后菌株GF3的總產(chǎn)孢量最大，為7.5×108個(gè)/皿，與其他幾個(gè)菌株的產(chǎn)孢量差異顯著，分別是菌株GF1 、GF2、GF4、GF5、GF6產(chǎn)孢量的2.86、1.94、4.29、6.67、3.33倍，同時(shí)，菌株GF3小孢子的產(chǎn)量為6.88×108個(gè)/皿，大孢子的產(chǎn)量為6.25×108個(gè)/皿(見圖4).

圖4 6株黃芪根腐病菌培養(yǎng)10 d的產(chǎn)孢量Fig.4 Spore production of 6 strains cultured for 10 days

表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，不同小寫字母(a、b、c)表示經(jīng)鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在P<0.05水平差異顯著.

2.4 致病力測(cè)定結(jié)果

接種6株病原菌7 d后，黃芪根段表面均出現(xiàn)不同程度的黑色病斑(見圖5和圖6)，切開后根內(nèi)部組織也不同程度的變褐，其中接種菌株GF3根段的病斑面積最大，且發(fā)黑變質(zhì)的程度也最大，病斑的直徑為1.43 cm，其次是菌株GF1，病斑直徑為1.11 cm，其他幾株病原菌的病斑直徑均在1 cm以下，由此可見6株菌株均具致病性，且菌株GF3的致病力最強(qiáng).

圖5 6株黃芪根腐病菌病斑大小Fig.5 Size of the spots of 6 strains of root rot of Astragalus membranaceus var.mongholicus

圖6 接種6株黃芪根腐病菌7 d后的病斑大小Fig.6 Size of the spots after inoculation with 6 strains of root rot of Astragalus membranaceus var.mongholicus for 7 days

2.5 纖維素酶測(cè)定結(jié)果

6株黃芪根腐病原菌產(chǎn)Cx的情況分別見圖7.6株菌均能產(chǎn)Cx，只是產(chǎn)酶開始時(shí)間、酶活力大小以及變化趨勢(shì)有所不同.菌株GF2-GF6均在3 d后開始產(chǎn)酶，菌株GF1在9 d后才開始產(chǎn)酶，6株病原菌的Cx活力隨著時(shí)間均為增加的趨勢(shì)，其中菌株GF3在第5 d、7 d、9 d以及11 d的酶活力均最大，11 d時(shí)的酶活力為2.395 U/mg.

圖7 6株黃芪根腐病菌產(chǎn)Cx能力比較Fig.7 Comparison of Cx production capacity of 6 strains of root rot of Astragalus membranaceus var. mongholicus

6株黃芪根腐病原菌產(chǎn)βG的情況分別見圖8.菌株GF3產(chǎn)酶時(shí)間最早，3 d時(shí)已有酶產(chǎn)生，菌株GF4和GF6在3 d后才開始產(chǎn)酶，菌株GF1、GF2和GF5在5 d后才開始產(chǎn)酶.6株病原菌9 d前的酶活力均逐漸增大，菌株GF3和GF4在的酶活在9 d后開始逐漸降低，菌株GF1、GF2、GF5和GF6的酶活性在9 d后幾乎沒有變化.在整個(gè)酶活變化的過程中菌株GF3的酶活性一直是最大的，在第9 d時(shí)達(dá)到峰值，為1.431 U/mg.

圖8 6株黃芪根腐病菌產(chǎn)βG能力比較Fig.8 Comparison of βG production capacity of 6 strains of root rot of Astragalus membranaceus var. mongholicus

2.6 果膠酶測(cè)定結(jié)果

6株黃芪根腐病原菌產(chǎn)PG酶的情況見圖9.6株病原菌在3 d以前均開始產(chǎn)PG酶，其中菌株GF1、GF2、GF3和GF6的酶活力在第3 d達(dá)到最高值，分別為506.42 U/mg、540.06 U/mg、620.21 U/mg和568.60 U/mg，菌株GF3的酶活力最高，3 d以后均逐漸降低，第9 d后有上升的趨勢(shì)，但是第11 d的酶活力均沒有第3 d高.菌株GF4和GF5第3 d到第5 d的酶活力逐漸增高，第5 d時(shí)達(dá)到峰值，分別為313.13 U/mg和222.623 U/mg，5 d到9 d逐漸降低，9 d后有升高的趨勢(shì)，但是第11 d的酶活力沒有3 d時(shí)高.

圖9 6株黃芪根腐病菌產(chǎn)PG能力比較Fig.9 Comparison of PG production capacity of 6 strains of root rot of Astragalus membranaceus var. mongholicus

6株黃芪根腐病原菌產(chǎn)PMG酶的情況見圖10， 6株病原菌的PMG活力均在第3 d時(shí)達(dá)到峰值，菌株GF1-GF6第3 d的酶活力分別為159.62 U/mg、84.23 U/mg、179.71 U/mg、142.30 U/mg、132.41 U/mg和122.48 U/mg，其中菌株GF3的酶活力最大.在第3 d～7 d時(shí)間段6株病原菌的酶活力均逐漸降低.菌株GF3和GF6的酶活力在第7 d～9 d有下降趨勢(shì)，9 d～11 d又逐漸上升.菌株GF1、GF2、GF4和GF5的酶活力在7 d～9 d呈增高趨勢(shì)，在第9 d～11 d又逐漸降低.

6種黃芪根腐病菌產(chǎn)PGTE的情況見圖11，6株病原菌中除了菌株GF2在第3 d沒有產(chǎn)PGTE外，其他5株病原菌均產(chǎn)酶.菌株GF4的酶活力在3 d～11 d為逐漸降低的趨勢(shì)，但是在整個(gè)過程中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的酶活力均高于其他5株病原菌.菌株GF4、GF5和GF6在第3 d的酶活力最高，分別為61.24 U/mg、24.33 U/mg、30.79 U/mg，以后均有逐漸降低的趨勢(shì).菌株GF2和GF3在第3 d～9 d的酶活力逐漸增高，9 d～10 d為降低的趨勢(shì).菌株GF1第3 d～5 d的酶活力趨于平穩(wěn)，5 d后逐漸降低.

圖11 6株黃芪根腐病原菌產(chǎn)PGTE能力比較Fig.11 Comparison of PGTE production capacity of 6 strains of root rot of Astragalus membranaceus var.mongholicus

6種黃芪根腐病原菌產(chǎn)PMTE的情況見圖12，6株病原菌在第3 d均有最高的PMTE活力，分別為100.11 U/mg、135.76 U/mg、69.32 U/mg、78.32 U/mg、35.75 U/mg、14.98 U/mg.菌株GF1、GF2、GF4、GF5、GF6在第3 d～11 d的酶活力均逐漸降低，在第11 d達(dá)到最低值.菌株GF3第3 d～5 d的酶活力逐漸降低，5 d～7 d逐漸升高，但是7 d的酶活力為51.59 U/mg沒有高于第3 d，第7 d～11 d的酶活力逐漸降低.

圖12 6株黃芪根腐病原菌產(chǎn)PMTE能力比較Fig.12 Comparison of PMTE production capacity of 6 strains of root rot of Astragalus membranaceus var.mongholicus

3 討論

陳垣等[10]的研究結(jié)果表明尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)為甘肅渭源黃芪根腐病的主要致病菌，且尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的致病力最強(qiáng)，本研究從甘肅渭源采集的黃芪根腐病樣上分離得到的6株病原菌均鑒定為茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)，并未分離出尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，在對(duì)分離得到的6株茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)進(jìn)行回接試驗(yàn)，均能使黃芪根段產(chǎn)生出現(xiàn)不同程度的黑色病斑，切開后根內(nèi)部組織有不同程度的變褐，這與采集的原始病組織的病斑形狀相同，其中菌株GF3的致病力最強(qiáng).且6株茄腐鐮刀菌在菌落特征、生長速率及產(chǎn)孢量上存在差異，這說明甘肅渭源地區(qū)近年黃芪根腐病病原菌的致病種群及其致病力方面發(fā)生了一定的變化.以前報(bào)道中對(duì)黃芪根腐病菌多是通過形態(tài)鑒定和rDNA-ITS序列分析鑒定，本文除此之外還進(jìn)行了EF-1α基因序列分析，使鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確.

本研究6株病原菌均能產(chǎn)生4種果膠酶(PG、PMG、PGTE、PMTE)和2種纖維素酶(Cx、βG).在產(chǎn)酶能力上6株病原菌產(chǎn)果膠酶的活力明顯優(yōu)于產(chǎn)纖維素酶的活力，在產(chǎn)酶時(shí)間上6株病原菌的果膠酶在3 d以前就已經(jīng)開始產(chǎn)生，第3 d酶活力已達(dá)最高，而兩種纖維素酶在3 d后才開始產(chǎn)酶，后續(xù)雖產(chǎn)酶活力逐漸升高，但是與4種果膠酶的酶活力相比還是較低.這與病原菌入侵寄主植物時(shí)，首先果膠酶降解胞間層以及初生壁中的果膠物質(zhì)，然后纖維素酶和半纖維素酶降解次生壁中的纖維素的致病機(jī)制相吻合[17].

病原菌產(chǎn)酶活性的大小在一定程度上能夠表明其致病力的大小，柴瑩等[18]的研究結(jié)果表明黑龍江省馬鈴薯干腐病的強(qiáng)致病菌株接骨木鐮孢菌(Fusariumsambucinum)和燕麥鐮孢菌(Fusariumavenaceum)在體內(nèi)培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的 Cx、β-葡萄糖苷酶、PG、PMG的活性均高于其他3種鐮孢菌，而弱致病菌株擬枝孢鐮孢菌(Fusariumsporotriodides)和擬絲孢鐮孢菌(Fusariumtrichothecioides)產(chǎn)生的這4種細(xì)胞壁降解酶活性較低.本研究中菌株GF3產(chǎn)生的2種果膠酶(PG、PMG)在第3 d的酶活力高于其他幾株菌株，產(chǎn)2種纖維素酶(Cx、βG)的酶活力在整個(gè)之間段均高于其他幾株病原菌，這可以表明菌株GF3的致病力強(qiáng)于其他5株病原菌與其侵染初期較高的2種果膠酶(PG、PMG)活性和后續(xù)較高2種纖維素酶(Cx、βG)活性有關(guān).

本研究只測(cè)定了黃芪根腐病菌在活體外產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶的活性，但是活體內(nèi)外的環(huán)境因素差異、體外誘導(dǎo)物不同以及植物自身抗病性等均會(huì)導(dǎo)致活體內(nèi)外酶活性有一定的差異[19]，金勤等[20]的研究發(fā)現(xiàn)油茶炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporiqides)在活體內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性明顯低于活體外.因此本研究中每種菌株離體細(xì)胞壁降解酶活性的測(cè)定并不能完全代表病原菌在自然狀態(tài)下活體內(nèi)的變化情況，但是能夠說明6株病原菌株之間所產(chǎn)酶的種類及酶活性之間的差異，這對(duì)探索其致病力差異具有一定意義.后續(xù)可以探究病原菌果膠酶和纖維素酶產(chǎn)生的分子機(jī)理，進(jìn)而揭示鐮刀菌的致病機(jī)理，并可以針對(duì)強(qiáng)致病力菌株進(jìn)行黃芪根腐病病害防治研究，這對(duì)田間黃芪根腐病的防治具有指導(dǎo)意義.

4 結(jié)論

甘肅渭源黃芪根腐病致病菌的主要類型為茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)，且分離所得的6株茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)菌株的致病力存在差異，這與其所產(chǎn)的細(xì)胞壁降解酶的種類和活力不同有關(guān).