連續(xù)動態(tài)逆流提取對香菇多糖抗氧化活性的影響

李德靈，林錦銘，陳海平，黎 攀，張全才，杜 冰

（1，無限極（中國）有限公司，廣州 510623；2，華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院，廣州 510642）

0 引言

香菇（Lentinus edodes）屬真菌門［1］，富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種活性成分，具有一定的食療與藥療效果，是我國最常見的食用菌之一［2］。據(jù)報道，香菇多糖具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗炎及抗衰老等多種生理活性［3-7］，在食品和醫(yī)藥等方面有非常廣闊的應用前景。目前提取香菇多糖的方法主要有熱水浸提法［8］、酸提取法和堿提取法［9-10］。熱水浸提法是在高溫條件下香菇細胞吸水膨脹破碎，香菇多糖從細胞內(nèi)擴散到溶劑中從而提取香菇多糖，是提取多糖最常見的一種方法。該方法成本低、工藝操作簡單，被廣泛應用于工業(yè)化生產(chǎn)。而酸提取法和堿提取法，雖然在一定程度上能夠提高粗多糖提取率，但需要引入大量的有機試劑，容易對環(huán)境造成污染，而且容易破壞多糖的生物活性。同時，運用超聲波、微波、酶法等技術(shù)手段輔助提取多糖［11-13］，也可以從一定程度上提高粗多糖得率，但其成本高、耗時耗能，在工業(yè)化運用方面較少，此外微波作用于有機溶劑容易引發(fā)試驗潛在的危險［14］。因此，尋找一種提取率高、提取時間短、節(jié)能環(huán)保、操作簡便的提取方法已迫在眉睫。

動態(tài)逆流提取技術(shù)（DCE）能夠充分利用系統(tǒng)中固液兩相的濃度梯度［15-16］，使提取液出料時達到更高濃度的平衡［17］。這不僅可以提高被提取物的提取率，還能節(jié)約能耗、縮短提取時間［18］，滿足了部分原料功能成分的高效提取需求。目前，該技術(shù)研究主要集中在動態(tài)逆流提取工藝條件的優(yōu)化［19-21］，主要應用于藥品功能成分的提?。?2］，在香菇多糖的提取應用方面還未見報道。因此，本研究將動態(tài)逆流提取技術(shù)運用于香菇多糖的提取，并研究其對香菇多糖提取率及抗氧化能力的影響。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

香菇（無限極（中國）有限公司）；2，4，6-三吡啶基三嗪、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），Aladdin；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、硫酸亞鐵、苯酚、水楊酸、葡萄糖等均為分析純（天津市大茂化學試劑廠）。

動態(tài)逆流設(shè)備（江蘇華泰制藥機械有限公司）；電子天平ME204E（梅特勒-托利多公司）；UV-3802紫外分光光度計（上海儀田精密儀器有限公司）；HH-S6型電熱恒溫水浴鍋（常州市萬豐儀器制造有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 總糖含量的測定

香菇多糖的含量采用苯酚-硫酸法［23］進行測定，試驗得總糖標準曲線回歸方程為：Y=44.234 42x+0.022，R=0.999，線性關(guān)系良好。其中，x表示質(zhì)量濃度（mg/mL），y表示吸光度。

1.2.2 香菇多糖的提取

將香菇于60 ℃干燥至恒重，然后進行粉碎，過40目篩制得香菇粉備用。將動態(tài)逆流提取罐機組串聯(lián)，精密稱取200 g香菇粉于罐組式動態(tài)逆流提取儀中，然后加入4 L蒸餾水（料液比1：20）90 ℃提取香菇多糖，提取時間為 2 h，提取溶劑沿原料溶質(zhì)濃度由低向高輸送經(jīng)過各罐并多次套用［24］。動態(tài)平衡后，在 0 min、20 min和 40 min取樣，冷卻抽濾后于55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進行濃縮［25］，得到的濾液定容至 100 mL。

Sevag法［26］脫去蛋白后用4倍體積的乙醇醇沉過夜，經(jīng)離心后將沉淀復溶并冷凍干燥得到香菇多糖。其他條件相同，以相同質(zhì)量的香菇原料運用熱水回流法提取得到香菇多糖為對照組。其他條件一致，以同等質(zhì)量的香菇樣品，用熱水提取法提取的香菇多糖溶液作為對照組。

1.2.3 多糖抗氧化能力的測定

香菇多糖的抗氧化能力通過檢測多糖對O2-、·OH、DPPH自由基清除能力以及鐵離子的還原能力進行測定。其中O2-·、·OH和DPPH自由基清除能力分別采用鄰苯三酚法［27］、Fenton法和Kamble P等的方法進行測定［28-29］，并參照韓洪坤等［30］的方法對鐵原子還原能力進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016處理，用SPASS 19.0進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 連續(xù)動態(tài)逆流提取方法對香菇多糖得率的影響

2.1.1 動態(tài)逆流提取對提取液多糖濃度的影響

從圖1可以看出，連續(xù)動態(tài)逆流提取的香菇多糖濃度顯著高于對照組（3.23 mg/mL），連續(xù)動態(tài)逆流提取平衡后20 min所得香菇提取液的多糖濃度最高為5.70 mg/mL，較動態(tài)逆流平衡后0 min（5.03 mg/mL）和 40min（5.55 mg/mL）所得多糖濃度高。這可能是因為連續(xù)動態(tài)逆流提取香菇多糖過程中，溶劑存在連續(xù)的濃度梯度，使得多糖充分向外擴散，提取液多糖濃度較高［31］。因此，運用連續(xù)動態(tài)逆流提取法提取香菇多糖可以顯著提高多糖溶出率。

圖1 動態(tài)逆流提取對香菇多糖提取液濃度的影響Fig.1 Effect of dynamic countercurrent extraction on the concentration of lentinus edodes polysaccharide extract

2.1.2 動態(tài)逆流提取對香菇多糖得率的影響

由圖2可知，運用連續(xù)動態(tài)逆流提取法的香菇得率顯著高于對照組（3.20%），其中連續(xù)動態(tài)逆流提取平衡后20 min所得香菇多糖提取率為8.43%，且明顯高于平衡后0 min（7.86%）和40min（8.07%）的香菇多糖得率。綜上可知，采用連續(xù)動態(tài)逆流法提取香菇多糖得率顯著高于熱水回流法，這可能是因為連續(xù)動態(tài)逆流提取充分利用了香菇粉和蒸餾水兩相的濃度梯度，逐級將多糖擴散至起始濃度較低的套提溶液中［32］，從而提高香菇多糖得率。此外，平衡后40 min取樣的多糖得率稍微下降，可能是隨著時間的延長，其他水溶性雜質(zhì)溶于溶劑的量增大［33］。因此，選用連續(xù)動態(tài)逆流提取平衡后20 min抽濾濃縮后制得香菇多糖，并進一步探究其抗氧化能力。

圖2 動態(tài)逆流提取對香菇多糖得率的影響Fig.2 Effect of dynamic countercurrent extraction on the yield of lentinus edodes polysaccharide

2.2 動態(tài)逆流提取對香菇多糖抗氧化能力的影響

2.2.1 動態(tài)逆流提取對羥自由基清除率的影響

多糖的抗氧化作用通常用羥自由基清除能力來評估，羥自由基會引起賴氨酸迅速損傷，誘發(fā)疾病。由圖3可見，兩種工藝提取的香菇多糖羥自由基清除率都隨香菇多糖濃度的增大而增大，動態(tài)逆流提取法所得香菇多糖對羥自由基的清除能力顯著高于熱水回流法得到的香菇多糖羥自由基清除率。動態(tài)逆流提取的香菇多糖濃度在1 mg/mL到1.5 mg/mL逐漸增大時，香菇多糖羥自由基清除率顯著增大。

圖3 動態(tài)逆流提取對香菇多糖羥自由基清除率的影響Fig.3 Effect of dynamic countercurrent extraction on scavenging rate of hydroxyl radical of Lentinus edodes polysaccharide

2.2.2 動態(tài)逆流提取對超氧自由基清除率的影響

動態(tài)逆流提取對香菇多糖超氧自由基清除率的影響如圖4所示。

由圖4可見，連續(xù)動態(tài)逆流提取的香菇多糖對超氧自由基清除率明顯高于普通熱水回流法提取的香菇多糖自由基清除率，兩種工藝提取的香菇多糖對超氧自由基的清除率都隨香菇多糖濃度增大而增大。當連續(xù)動態(tài)逆流提取的香菇多糖濃度從0.5 mg/mL增加到1.5 mg/mL時，香菇多糖對超氧自由基的清除率顯著增加。

2.2.3 動態(tài)逆流提取對DPPH自由基清除率的影響

超氧自由基的生成和清除的平衡對于機體維持正常的生理活動具有重要意義。由圖5可見，在香菇多糖濃度為0.5 mg/mL到1.5 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，采用動態(tài)逆流提取工藝提取的香菇多糖對DPPH自由清除率比一般的熱水回流提取的香菇多糖高，濃度超過1.5 mg/mL時，二者對DPPH自由清除率接近。說明動態(tài)逆流提取得到的香菇多糖相對熱水回流提取得到的香菇多糖在多糖濃度較低時（0.5～1.5 mg/mL）具有更強的DPPH自由基清除能力。二者對DDPH自由基清除率均隨香菇多糖濃度增大而增大。

2.2.4 動態(tài)逆流提取對Fe還原力的影響

由圖6可見，兩種提取方法得到的香菇多糖抗氧化能力均隨多糖濃度的增大而增大。在香菇多糖濃度為0.1 mg/mL到0.5 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，采用動態(tài)逆流提取工藝提取的香菇多糖對Fe還原力比一般的熱水回流提取的香菇多糖高，連續(xù)動態(tài)逆流提取所得香菇多糖抗氧化能力更強。

3 結(jié)語

連續(xù)動態(tài)逆流提取法提取的香菇多糖得率及其抗氧化能力均顯著高于普通熱水回流法提取的香菇多糖。香菇多糖質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時，連續(xù)動態(tài)逆流提取法提取的香菇多糖對O2-·、·OH和DPPH·清除率分別為71.35%、78.36%和70.36%，比熱水回流提取的香菇多糖提高了38.75%，52.36%和36.82%。同時，采用動態(tài)逆流提取的方法不用引入高壓和超聲設(shè)備，成本較低、工藝操作簡單、提取時間較短，在工業(yè)化應用方面有廣闊的前景。綜上，將連續(xù)動態(tài)逆流提取應用于香菇等植物的活性成分提取具有重要意義。