錦葵啶葡萄糖苷酶促?；磻?yīng)體系的研究及效果評價(jià)

王 政，黃名勇，周 彥，咼亞波，彭 非，鄧潔紅

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，長沙 410128；2.湖南省天香生物科技有限責(zé)任公司，湖南邵陽 422000；3.湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院，長沙 410208）

0 引言

花色苷（Anthocyanins）廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等植物器官的細(xì)胞液中，是一種重要的天然植物色素，色澤鮮艷。同時(shí)具有廣泛的生理和藥理活性［1］，擁有強(qiáng)大的抗氧化與清除自由基的作用；能降低血脂、甘油酯和膽固醇的水平；具有抗變異、抗腫瘤、抗過敏、保護(hù)胃黏膜等多種功能［2-3］。因此，花色苷在各種食品、藥品和化妝品工業(yè)中具有很好的應(yīng)用前景［4］。但由于花色苷自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，在加工貯藏過程中易受光、氧、溫度、pH值、金屬離子等因素影響［5-6］，限制了其在食品工業(yè)及其他領(lǐng)域的應(yīng)用。提高花色苷的穩(wěn)定性，是開發(fā)利用花色苷的當(dāng)務(wù)之急。

花色苷?；侵富ㄉ仗腔系牧u基被各種有機(jī)酸部分或完全酯化的現(xiàn)象，通過應(yīng)用化學(xué)方法，花色苷上所有的羥基都能在特定條件下被酸酯化［7］，花色苷母核結(jié)構(gòu)上糖苷基團(tuán)上的羥基通常能與一個(gè)或多個(gè)蘋果酸、咖啡酸、香豆酸、脂肪酸、對羥基苯甲酸和阿魏酸反應(yīng)形成單酰、二?；蚨圊；ㄉ眨?-9］，?；蟮幕ㄉ展狻岱€(wěn)定性得到提升［10］，證明花色苷?；翘岣咂浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要手段。

傳統(tǒng)化學(xué)法?；嬖谠S多缺陷［11］：催化反應(yīng)選擇區(qū)域性差，副產(chǎn)物較多；試驗(yàn)操作復(fù)雜，耗時(shí)長，產(chǎn)物穩(wěn)定性較差。酶法?；瘜Υ呋孜镉辛己玫膶Ｒ恍院瓦x擇性，反應(yīng)條件溫和，催化效果顯著，有效避免傳統(tǒng)化學(xué)法的缺陷，同時(shí)酶在非水介質(zhì)下作用還發(fā)揮出了在水溶液中沒有的優(yōu)勢［12-13］：非水介質(zhì)中酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好，區(qū)域選擇性專一；酶易固定，便于回收；固化后酶熱穩(wěn)定性高，可防止微生物污染。目前能在非水介質(zhì)中起到催化作用的酶已有數(shù)十種，能夠催化多種反應(yīng)，包括?；磻?yīng)［14-15］。

本研究旨在建立花色苷酶促?；姆磻?yīng)體系：通過單因素試驗(yàn)，根據(jù)酶在不同反應(yīng)介質(zhì)中的酶活確定最佳有機(jī)溶劑，利用花色苷濃度與呈色變化關(guān)系以及花色苷在光照條件下易分解的特定，對比酰化前后花色苷的殘留率和色差，確定最佳酶試劑、酶添加量、分子篩添加量和?；w；通過對比?；磻?yīng)前后錦葵啶葡萄糖苷的親脂性和熱穩(wěn)定性，探討酶促?；Ч?/p>

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

刺葡萄：采于湖南省中方縣刺葡萄果園，自來水淋洗、晾干表面水分后手剝皮，-24 ℃冷凍貯藏備用。

Candila antarctica 脂肪酶 B（CAL-B，Novozym 435） Rhizomucor miehei脂肪酶（RML，Lipozyme RM IM）購于諾維信生物技術(shù)有限公司；豬胰脂肪酶（Lipase from pocine pancreas）、植物脂肪酶（Lipase from plant）購于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

四氫呋喃（西隴科學(xué)股份有限公司）；二甲基四氫呋喃，對羥基苯甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司；苯甲酸乙烯酯，肉桂酸乙烯酯（梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）。

甲醇、乙醇、正辛醇、鹽酸、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、分子篩4A型（鈉-A型分子篩）、蔗糖、均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑股份有限公司分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AEY-220電子分析天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；UV-2450紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；TDZ5臺式低速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）；THZ-92A氣浴恒溫振蕩器（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）；BZ24/29 φ1.6×30 cm 玻璃層析柱（上海滬西分析儀器廠）；真空冷凍干燥機(jī)（丹麥Heto公司）；HJ-4A數(shù)顯恒溫多頭磁力攪拌器（上海比朗儀器有限公司）；PHSJ-3F pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；SMY-2000測色色差計(jì)（北京天創(chuàng)尚邦儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 刺葡萄花色苷單體的制備

以刺葡萄皮為原料，以料液比1：6加入80%乙醇（含0.03%鹽酸）提取，避光浸提24 h，抽濾。濾液于0.1 MPa真空度下40 ℃條件下濃縮回收乙醇，取色素濃縮液經(jīng)無水乙醚，無水乙酸乙酯萃分別萃取2次，脫除有機(jī)溶劑，真空蒸發(fā)得到花色苷粗提液。

錦葵花色苷的純化：HP-20樹脂預(yù)處理后濕法裝柱，花色苷粗提液進(jìn)樣至吸附飽和（流出液吸光度值為上樣液的1/10時(shí)。）首先用2BV蒸餾水沖洗，再用酸化乙醇（體積分?jǐn)?shù)80%、含0.05%鹽酸，8BV）洗脫，收集洗脫液于40 ℃真空濃縮，脫除乙醇［16］。

錦葵花色苷的單體分離［17］：Sephadex LH-20凝膠經(jīng)預(yù)處理后濕法裝柱，上述脫除乙醇后的洗脫液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)柱上樣，然后用酸化甲醇（體積分?jǐn)?shù)50%、含0.1%的TFA）洗脫，分部收集得到3種色素，真空凍干，結(jié)構(gòu)鑒定后，選取其一錦葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷（Malvidin-3，5-O-diglucoside）為試驗(yàn)單體。

1.3.2 有機(jī)溶劑脫水

在350 ℃條件下活化4A型分子篩8h。冷卻后置于干燥器中，添加有機(jī)溶劑過夜脫水12h，取液體部分備用。

1.3.3 脂肪酶活性的測定

參考GBT 23535—2009《脂肪酶制劑》測定4種脂肪酶的活性［18］。測量脂肪酶CAL-B，脂肪酶RM IM，豬胰脂肪酶，植物脂肪酶水解比活分別是 0.25 U/mg，1.20 U/mg，0.17 U/mg，0.98 U/mg。

1.3.4 脂肪酶的篩選

在4個(gè)帶塞小瓶中加入2 mL脫水2-MeTHF、0.01 mmol錦葵啶葡萄糖苷、0.10 g分子篩、0.15 mmol肉桂酸乙烯酯混合均勻，置于恒溫振蕩器中（45 ℃，200 r/min），分別加入40 U不同來源的脂肪酶（脂肪酶RM IM，CAL-B，豬胰脂肪酶，植物脂肪酶）啟動酶促反應(yīng)2 h，中止反應(yīng)［19］。將溶液抽濾，收集濾液。取1 mL濾液用體積分?jǐn)?shù)為0.01%的鹽酸甲醇溶液稀釋搖勻，定容至50 mL。測量并計(jì)算其花色苷殘留率及色差?？瞻捉M參照上述方法以不添加酶樣進(jìn)行對照。

1.3.5 不同有機(jī)溶劑對酶活的影響

在3個(gè)帶塞三角瓶中分別加入2 mL溶劑（丙酮、四氫呋喃、二甲基四氫呋喃），40 U酶（CAL-B、脂肪酶RM IM、植物脂肪酶、豬胰脂肪酶），放置于60 ℃恒溫振蕩器內(nèi)24 h，中止反應(yīng)。將溶液過濾后，置于35 ℃通風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥后，測定脂肪酶活性，對比有機(jī)溶劑處理前后脂肪酶酶活變化。

1.3.6 酶添加量對花色苷酶促酰化反應(yīng)的影響

在6個(gè)帶塞小瓶中加入2 mL脫水2-MeTHF、0.01 mmol錦葵啶葡萄糖苷、0.10 g分子篩、0.15 mmol肉桂酸乙烯酯混合均勻，置于恒溫振蕩器中（60 ℃，200 r/min），分別加入不同量的CAL-B（0 U、25 U、35 U、40 U、45 U、50 U）啟動酶促反應(yīng)24 h，中止反應(yīng)［20］。溶液抽濾，收集濾液。取1 mL濾液用體積分?jǐn)?shù)為0.01%的鹽酸甲醇溶液稀釋搖勻，定容至50 mL。測量并計(jì)算其花色苷殘留率及色差。以未添加脂肪酶作為參照組。

1.3.7 最佳分子篩添加量的確定

在5個(gè)帶塞小瓶中加入2 mL脫水2-MeTHF、0.01 mmol錦葵啶葡萄糖苷、分別加入不同量的分子篩（0 g、0.05 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g）、0.15 mmol肉桂酸乙烯酯混合均勻，置于恒溫振蕩器中（60 ℃，200 r/min）加入50 U脂肪酶CAL-B啟動，酶促反應(yīng)24 h。中止反應(yīng)后，溶液抽濾，取1 mL濾液用體積分?jǐn)?shù)為0.01%的鹽酸甲醇溶液稀釋搖勻，定容至50 mL，備用。測量并計(jì)算其花色苷殘留率及色差。以未添加分子篩作為空白對照組。

1.3.8 ?；w的篩選

在4個(gè)帶塞小瓶中加入2 mL脫水2-MeTHF、0.01 mmol錦葵啶葡萄糖苷、0.15 g分子篩、0.15 mmol（肉桂酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、對羥基苯甲酸）混合均勻，置于恒溫振蕩器（60 ℃，200 r/min）中，加入50 U脂肪酶CAL-B啟動反應(yīng)24 h，中止反應(yīng)。將溶液抽濾，取1 mL濾液用體積分?jǐn)?shù)為0.01%的鹽酸甲醇溶液稀釋搖勻，定容至50 mL。測量并計(jì)算其花色苷殘留率及色差?？瞻捉M參照上述方法處理以不添加酰基供體對照。

1.3.9 花色苷殘留率的計(jì)算

根據(jù)朗博比爾定律，溶液的濃度與其吸光度呈正比，故而可以利用紫外-可見分光光度法測量花色苷含量。對段煜［21］評定花色苷?；Ч椒ㄟM(jìn)行適當(dāng)修改。

取10 mL定容稀釋后的濾液放置于常溫條件下中避光靜置1 h。在波長530 nm處測定吸光度作為初始值A(chǔ)0，然后置于日光光照條件下，經(jīng)3 h后測定溶液在波長530 nm處的吸光度為At，以錦葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷單體進(jìn)行對照。

花色苷殘留率=At/A0×100%

式中 At——在40 ℃光照3 h后花色苷溶液的吸光度；

A0——光照前花色苷溶液的吸光度。

1.3.10 色差值的測定

色澤以亮度L*值、紅綠a*值、黃藍(lán)b*值表示［22］。吸取定容稀釋后濾液5 mL，在40 ℃光照3 h后用測色色差計(jì)測定其色澤。記錄L*、a*、b*數(shù)值。

1.3.11 紫外-可見光譜分析

在帶塞小瓶中加入2 mL脫水2-MeTHF、0.01 mmol錦葵啶葡萄糖苷、0.15 g分子篩、0.15 mmol肉桂酸乙烯酯混合均勻，置于恒溫振蕩器（60 ℃，200 r/min）中，加入50 U不同來源的脂肪酶CAL-B啟動反應(yīng)24 h，中止反應(yīng)。將溶液抽濾后，取1 mL濾液用體積分?jǐn)?shù)為0.01%的鹽酸甲醇溶液稀釋搖勻，定容至50 mL。在200～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見光譜掃描，分析其光譜特征［23］。用錦葵啶葡萄糖苷參照上述方法處理但不添加酶樣進(jìn)行對照。

1.3.12 ?；a(chǎn)物的親脂性測定

通過測定物質(zhì)的油水分配系數(shù)對其親脂性進(jìn)行評價(jià)。將100 μm的未酰化的錦葵啶葡萄糖苷和己?；腻\葵啶葡萄糖苷溶解于2 mL的正辛醇當(dāng)中，分別加入2 mL的水，200 r/min下離心10 min后，靜置，對正辛醇層和水層進(jìn)行分液，分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸干，測定正辛醇和水層中的物質(zhì)含量，并計(jì)算分配系數(shù)，平行試驗(yàn)3次，取其平均值。結(jié)果以logP表示，方程式如下：

P= Co/Cw

式中 Co——平衡時(shí)物質(zhì)在正辛醇相中的濃度；

Cw——平衡時(shí)物質(zhì)在水相中的濃度。

1.3.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每組試驗(yàn)設(shè)定3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進(jìn)行顯著性分析檢驗(yàn)（顯著性水平為p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳有機(jī)溶劑的確定

試驗(yàn)選取丙酮、二甲基四氫呋喃和四氫呋喃三種有機(jī)溶劑進(jìn)行篩選，對比RM IM、CAL-B、豬胰脂肪酶和植物脂肪酶在不同有機(jī)溶劑中酶活的變化。結(jié)果如表1所示，四種酶在二甲基四氫呋喃和四氫呋喃溶劑中酶活損失均較小；RM IM和CAL-B在二甲基四氫呋喃溶劑中的酶活損失率最低，分別為21.67%和16%，因此選取二甲基四氫呋喃作為花色苷酶促?；磻?yīng)的反應(yīng)介質(zhì)。

表1 不同有機(jī)溶劑中酶的活性Tab.1 The activity of enzymes in different organic solvents U/mg

2.2 脂肪酶種類對酶促酰化的影響

試驗(yàn)對比四種脂肪酶催化花色苷酶促?；磻?yīng)的效果，利用反應(yīng)后花色苷的殘留率和色差變化確定最佳脂肪酶試劑?；ㄉ諝埩袈试礁?，說明花色苷在光照條件下分解的量越少，證明花色苷更穩(wěn)定。由圖1可知，四種脂肪酶催化花色苷?；磻?yīng)后，花色苷殘留率均得到提升，進(jìn)一步證明了?；苡行У靥嵘ㄉ盏姆€(wěn)定性。其中由脂肪酶RM IM和脂肪酶CAL-B催化效果最好，酰化后花色苷的殘留率最高，由脂肪酶CAL-B催化后酰化產(chǎn)物殘留率達(dá)88.1%。對比?；蠡ㄉ諝埩袈剩_定脂肪酶的優(yōu)先選擇為：CAL-B＞RM IM。研究表明：花色苷的含量與L*亮度呈負(fù)相關(guān)，與a*紅色色調(diào)呈正相關(guān)［24］。

圖1 脂肪酶種類對酰化產(chǎn)物花色苷殘留率的影響Fig.1 The effects of lipases on the residue rate of anthocyanin in acylates

四種脂肪酶酶促?；蠡ㄉ盏纳钪等绫?所示，與未?；幕ㄉ障啾龋；ㄉ盏腖*亮度下降，a*紅色色調(diào)上升，光照處理后?；ㄉ盏暮枯^未酰化花色苷的多，?；ㄉ崭€(wěn)定，進(jìn)一步證明了?；軌蛱岣呋ㄉ盏姆€(wěn)定性。其中使用脂肪酶CAL-B催化花色苷?；磻?yīng)，花色苷的L*亮度最低，a*紅色色調(diào)最高，說明酶促?；磻?yīng)效果最好。綜合比較不同脂肪酶對花色苷的殘留率和色差值影響，脂肪酶CAL-B的酶促?；Ч詈?，因此選擇脂肪酶CAL-B作為花色苷酶促酰化反應(yīng)體系的目的用酶。

表2 不同種類的酶對酶促?；\葵啶葡萄糖苷色差值的影響Tab.2 Effects of the types of enzymes on the color of enzymatic acylated malvidin glocoside

2.3 最佳脂肪酶添加量的確定

由圖2可知，當(dāng)脂肪酶添加量為0至45 U時(shí)，隨著脂肪酶添加量的增加，?；蠡ㄉ盏臍埩袈食试鲩L趨勢，此時(shí)脂肪酶添加量越多，花色苷更穩(wěn)定，?；Ч胶?。而脂肪酶添加量從45 U到50 U時(shí)，花色苷殘留率雖有增大，但效果不顯著。另根據(jù)花色苷色差值與其含量的關(guān)系，考察脂肪酶添加量對花色苷色差的影響，結(jié)果如表3所示。與空白對照對比，隨著脂肪酶添加量的不斷增加，花色苷的L*亮度不斷降低，a*紅色色調(diào)逐漸上升，隨著酶添加量的增加，這一變化趨勢不再顯著?？紤]酶在貯藏過程中容易失活，適當(dāng)多添加脂肪酶易提高脂肪酶與底物作用，促進(jìn)?；磻?yīng)進(jìn)行，綜合考慮選取50U為脂肪酶最佳量。

圖2 酶添加量對酰化產(chǎn)物花色苷殘留率的影響Fig.2 The effects of enzyme amount on the residue rate of anthocyanin in acylates

表3 酶添加量對酶促?；\葵啶葡萄糖苷差值的影響Tab.3 Effects of enzyme amount on the color difference of the enzymatic acylated malvidin glocoside

2.4 最佳分子篩添加量的確定

在花色苷酶促酰化反應(yīng)中，添加分子篩的目的為控制酶反應(yīng)體系的含水量，在適當(dāng)?shù)暮肯聲龠M(jìn)?；磻?yīng)的進(jìn)行［25］。不同分子篩添加量對花色苷殘留率的影響如圖3所示，添加分子篩后，酶促酰化反應(yīng)體系中含水量降低，產(chǎn)物花色苷的殘留率得到提高，花色苷的穩(wěn)定性得到提升。其中，當(dāng)分子篩添加量從0至0.15 g過程中，隨著分子篩添加量的增加，產(chǎn)物花色苷殘留率提高效果顯著，而繼續(xù)增加分子篩添加量至0.2 g，增速減緩，提升效果不顯著。另外，分子篩添加量對酶促酰化錦葵啶葡萄糖苷色差同樣具有顯著影響，結(jié)果如表4所示。

圖3 分子篩添加量對?；a(chǎn)物花色苷殘留率的影響Fig.3 The effects of molecular sieve addition amount on the residue rate of anthocyanin in acylates

表4 分子篩添加量對酶促酰化錦葵啶葡萄糖苷色差的影響Tab.4 Effects of molecular sieve addition amount on the color difference of the enzymatic acylated malvidin glocoside

對比空白組，在分子篩添加量為0～0.15 g時(shí)，隨著分子篩添加量的增加，產(chǎn)物的L*亮度呈降低趨勢，a*紅色色調(diào)呈上升趨勢，此時(shí)分子篩添加量越多，反應(yīng)體系含水量越少，?；a(chǎn)物越穩(wěn)定，?；Ч胶?。當(dāng)分子篩的添加量從0.15 g加到0.2 g時(shí)，花色苷的L*亮度反而增加，a*紅色色調(diào)降低，這是因?yàn)樵跓o水體系中，酶促?；磻?yīng)反應(yīng)困難，底物轉(zhuǎn)化率低于10%，當(dāng)體系中水含量為10%左右時(shí)，底物的最大轉(zhuǎn)化率提高到90%。因此，繼續(xù)增加分子篩的添加量，反應(yīng)體系的水含量會更低，反而不利于酰化反應(yīng)的進(jìn)行。綜合考慮，確定分子篩的最佳添加量為0.15 g。

2.5 ?；w的篩選

可用于酶促?；磻?yīng)的酰基供體可分為兩類：（1）形成可逆反應(yīng)的?；w，如羧酸烷基酯和羧酸等。選取此類?；w的?；磻?yīng)的反應(yīng)速度和產(chǎn)率都較低。（2）形成不可逆反應(yīng)的?；w，如乙烯酯類［26-27］。此類酰基供體具有很多優(yōu)良性質(zhì)，當(dāng)受體與?；w發(fā)生作用后，生成的不穩(wěn)定的烯醇產(chǎn)物會迅速轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的酮或醛。不同?；w對花色苷殘留率和色差的影響如圖4和表5所示。可以看出，選取肉桂酸乙烯酯作為酰基供體時(shí)，?；a(chǎn)物的殘留率最高，L*亮度最低，a*紅色色調(diào)最高，說明?；a(chǎn)物穩(wěn)定性最好，因此選取肉桂酸乙烯酯作為?；磻?yīng)的?；w。

圖4 酰基供體對?；a(chǎn)物花色苷殘留率的影響Fig.4 The effect of acyl donor on the residue rate of anthocyanin in acylates

表5 ?；w對酶促酰化錦葵啶葡萄糖苷色差影響Tab.5 Effects of acyl donor on the color difference of the enzymatic acylated malvidin glocoside

2.6 紫外-可見光譜分析

酶促?；昂蟮腻\葵啶葡萄糖苷紫外可見光譜如圖5所示。由圖5可知，錦葵啶葡萄糖苷在530 nm，290 nm處附近均有明顯特征峰最大吸收峰，樣品可以確定為花色苷樣品；酶促?；幚砗蟮腻\葵啶葡萄糖苷樣品在535 nm處以及290 nm有花色苷特征吸收峰，且在325 nm附近出現(xiàn)了?；鶊F(tuán)特征峰，證明酶促?；幚砭哂絮；Ч?，生成得到酰化錦葵啶葡萄糖苷。

圖5 酶促酰化前后錦葵啶葡萄糖苷紫外光譜圖Fig.5 The ultraviolet-visible spectra of the sample before and after enzymatic acylation of malvidin glocoside

2.7 ?；\葵啶葡萄糖苷親脂性分析

由表6可知，未?；腻\葵啶葡萄糖苷的油水分配系數(shù)為0.23，基本是沒有親脂性的，而經(jīng)過?；w酰化后的錦葵啶葡萄糖苷的油水分配系數(shù)達(dá)到了3.68，親脂性明顯增強(qiáng)。此油水分配系數(shù)反應(yīng)了物質(zhì)的親脂性，由此可以證明?；蟮腻\葵啶葡萄糖苷具有良好的親脂性，大大拓寬了錦葵啶葡萄糖苷的使用范圍和應(yīng)用領(lǐng)域。

表6 錦葵啶葡萄糖苷?；昂笾苄缘谋容^Tab.6 Comparison of fat solubility before and after acylation of malvidin glocoside

3 結(jié)論

（1）建立得到錦葵啶葡萄糖苷酶促酰化反應(yīng)體系。以酶活為指標(biāo)，從三種有機(jī)溶劑反應(yīng)介質(zhì)（丙酮，2-MeTHF、THF），選出酶促?；罴逊磻?yīng)溶劑。結(jié)果表明不同種類的酶，在有機(jī)溶劑介質(zhì)中耐受度不同，四種酶均在2-MeTHF中保持有良好的酶活性，其中兩種固定化脂肪酶優(yōu)于兩種酶粉，酶活損失較少，而CAL-B耐受性最好，篩選出最佳反應(yīng)溶劑為2-MeTHF；以?；a(chǎn)物花色苷殘留率及色差值為指標(biāo)，對比分析四種脂肪酶（CAL-B、脂肪酶RM IM、豬胰脂肪酶、植物脂肪酶）?；Ч?，篩選出CAL-B為最佳用酶；對比三種?；w（肉桂酸乙烯酯，苯甲酸乙烯酯，對羥基苯甲酸），篩選得出肉桂酸乙烯酯為最佳?；w。

（2）以酰化產(chǎn)物花色苷殘留率及色差值為指標(biāo)，考查分子篩添加量，酶添加量對錦葵啶葡萄糖苷酶促?；Ч绊憽＝Y(jié)果表明分子篩以及酶量均對錦葵啶葡萄糖苷酶促?；写龠M(jìn)效果，對L*值，a*值有顯著性影響，試驗(yàn)結(jié)果表明分子篩添加量為0.15 g，酶添加量為50 U為最佳試驗(yàn)條件。

（3）按照所建立的反應(yīng)體系，以2-MeTHF為有機(jī)溶劑，CAL-B為酰化酶，肉桂酸乙烯酯為?；w，分子篩添加量為0.15 g，酶添加量為50 U為酶促?；磻?yīng)條件，對結(jié)果進(jìn)行紫外-可見光譜分析。對比酰化前后試樣的紫外-可見光譜，在325 nm附近出現(xiàn)了?；鶊F(tuán)特征峰，說明發(fā)生了不可逆酰化反應(yīng)。

（4）通過?；磻?yīng)對錦葵啶葡萄糖苷進(jìn)行分子修飾，提純分離制備后旋干備用，通過測定其油水分配系數(shù)來測定其親脂性。被酰化的花色苷的油水分配系數(shù)由0.23提高到7.68，親脂性明顯提高，為花色苷在食品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用提供了保障。相較未酰化的錦葵啶葡萄糖苷，?；蟮腻\葵啶葡萄糖苷的熱穩(wěn)定性顯著提高，可以推斷?；清\葵啶葡萄糖苷穩(wěn)定性提高的根本原因。