葛根素減輕輻射誘發(fā)的大鼠急性腸黏膜損傷的實(shí)驗(yàn)研究

左振魁韓佳瑞*計(jì)樹靈賀璐璐段曉宇范 颯?？到?/p>

(1.河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)肛腸科,鄭州 450000;2.河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州 450000)

放療是惡性腫瘤治療的最重要的策略之一,大約有一半的癌癥患者接受放療[1]。 盡管放療對(duì)惡性腫瘤有確切的療效,但放療也會(huì)引起正常組織的毒性反應(yīng),這其中就包含了胃腸道消化系統(tǒng)、造血系統(tǒng)和腦血管系統(tǒng)的急性放射綜合癥[2-3]。 高劑量(≥9 Gy)的全身輻射會(huì)觸發(fā)急性胃腸道毒性,甚至可能會(huì)導(dǎo)致患者的死亡[4-5]。 據(jù)報(bào)道[6-7],輻射可以引起正常細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng),并甚至導(dǎo)致正常細(xì)胞壞死。 腸道對(duì)放射線高度敏感,因此放射線導(dǎo)致的腸道上皮和內(nèi)皮損傷在急性放射反應(yīng)的發(fā)展中起重要作用[8]。

葛根素(puerarin,Pue)是從葛根的根莖中提取的具有藥理活性的化合物[9]。 Pue 具有包括緩解胰島素抵抗、抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗心肌損傷等廣泛的生物活性,并已被當(dāng)作替代藥物來(lái)治療各種代謝性、炎癥性和心血管疾病[10-12]。 先前已有報(bào)道[13],Pue 對(duì)大鼠的電離輻射損傷具有保護(hù)作用,其保護(hù)機(jī)制可能與其抗氧化性有關(guān)。 然而,Pue 在輻射誘發(fā)的腸道損傷的具體作用機(jī)理仍不清楚。 因此,本研究的目的是對(duì)Pue 在保護(hù)大鼠免于輻射誘發(fā)的腸道損傷中的作用以及潛在的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只 7 周齡 SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠(190~210)g購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(豫)2017-0001],將大鼠飼養(yǎng)在溫度(20℃~25℃)和濕度(50% ~65%)的河南省中醫(yī)院SPF 級(jí)動(dòng)物房[SYXK(豫)2016-0008]的飼養(yǎng)籠中,每天進(jìn)行明暗12 h/12 h循環(huán),可自由獲得食物和水。 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)步驟均經(jīng)過(guò)河南省中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2016060101),并符合實(shí)驗(yàn)大鼠的3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

葛根素注射液(浙江康恩貝制藥股份有限公司生產(chǎn))購(gòu)自本院門診藥房;血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1,PECAM1)抗體(sc-1506)和 β 微管蛋白(β-tubulin)抗體(sc-8035)購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公 司; 抗 原 Ki-67 ( Ki-67 antigen, Ki67) 抗 體(DRM004)購(gòu)于美國(guó)Acris Antibodies 公司;閉合蛋白-1(Claudin-1)抗體(ab15098)購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司;閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens protein-1,ZO-1)抗體(21773-1)購(gòu)于美國(guó)Proteinteck 集團(tuán)公司武漢三鷹生物技術(shù)分公司;丙二醛(malonyldialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒(S0131) 和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性試劑盒(S0103)購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。 Clinac 2100C/D型線性加速器(Varian 公司,美國(guó));Eclipse 80i 型熒光顯微鏡(Nikon 公司,日本);I170-4500 型垂直電泳電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad 公司,美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理

適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后,將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control,Con)、單純輻射組(radiation,RT)和輻射+葛根素組(RT+Pue),每組8 只大鼠。 通過(guò)單劑量12 Gy 下腹部照射構(gòu)建輻射誘發(fā)的大鼠腸損傷模型,步驟簡(jiǎn)述如下:將大鼠固定在手術(shù)板上(不使用麻醉劑),用遮板(鉆一個(gè)直徑3 cm 圓孔,用于暴露大鼠下腹部)覆蓋大鼠,并利用Clinac 2100C/D 型線性加速器(6 MV X 射線,劑量率4 Gy/min,源距100 cm)單劑量12 Gy 照照放射大鼠下腹部。 對(duì)照組大鼠使用遮板完全覆蓋身體,單純輻射組和輻射+葛根素組大鼠采用上述照射方式進(jìn)行輻射。 輻射結(jié)束后,輻射+葛根素組大鼠采用尾靜脈注射15 mg/(kg·d)(臨床實(shí)踐中人用藥劑量通過(guò)體表轉(zhuǎn)換所得)葛根素,連續(xù)給藥7 d;對(duì)照組和單純輻射組大鼠采用相同方式在相同時(shí)間段通過(guò)尾靜脈注射等體積的生理鹽水。

1.3.2 樣品采集

第8 天,麻醉大鼠后,斷頭處死,收集大鼠小腸的空腸段。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),空腸組織被分為兩個(gè)部分。 一部分空腸組織固定在10%的中性緩沖多聚甲醛中,制作石蠟包埋組織,被制備4 μm 厚的空腸組織切片,以用于后續(xù)組織學(xué)和免疫組化檢測(cè);另一部分空腸組織直接凍存在-70℃,以用于后續(xù)免疫印跡分析。

1.3.3 病理形態(tài)學(xué)觀察

取空腸石蠟切片,經(jīng)脫蠟、再水化后,行常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。 每只大鼠任取4 個(gè)不同的空腸切片在Eclipse 80i 顯微鏡白光視野下觀察,并采用隨機(jī)視野拍照。 通過(guò)Image J 軟件計(jì)數(shù)空腸橫斷面中的隱窩計(jì)數(shù)和杯狀細(xì)胞密度數(shù)并測(cè)量腸絨毛長(zhǎng)度。

1.3.4 免疫組化染色

每只大鼠任取4 個(gè)不同的空腸切片,經(jīng)脫蠟、再水化、3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和封閉非特異性蛋白后,室溫孵育一抗(PECAM1,1 ∶100 稀釋;Ki67,1 ∶200 稀釋)2 h,甩干并用 PBS 洗 5 min × 5次,室溫孵育二抗30 min,甩干并用PBS 洗5 min ×5 次,DAB 顯色5 min,蘇木精復(fù)染15 s,0.1% HCl分化、藍(lán)化、脫水干燥和透明后,Eclipse 80i 顯微鏡白光視野下觀察,并采用隨機(jī)視野拍照,用Image J軟件統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性信號(hào)值。

1.3.5 免疫印跡分析

通過(guò)蛋白印跡法檢測(cè)緊密連接(tight junction,TJ)蛋白 claudin-1 和ZO-1 的表達(dá)。 取空腸組織并用RIPA 裂解液在4℃下勻漿。 勻漿液在4℃下以1.4×105r/min 離心 15 min 后,收集總蛋白。 蛋白定量后,取25 mg 蛋白在10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠行電泳分離,并電轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。 用5%脫脂奶粉封閉膜后,將膜與一抗(Claudin-1,1 ∶1000 稀釋;ZO-1,1 ∶2000 稀釋;β-tubulin,1 ∶5000 稀釋)在室溫下孵育 2 h,洗滌后,將膜用 HRP 偶聯(lián)的二抗(1 ∶4000 稀釋)在室溫下孵育1.5 h,洗滌后,用化學(xué)發(fā)光法對(duì)蛋白條帶顯影。 用Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行光密度值測(cè)定,并將目標(biāo)蛋白的光密度值相對(duì)于β-tubulin光密度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3.6 SOD 活性和MDA 水平測(cè)定

取空腸組織并用RIPA 裂解液在4℃下勻漿。取勻漿液進(jìn)行蛋白定量后,按照試劑盒說(shuō)明書步驟,進(jìn)行測(cè)量組織中的SOD 活性和MDA 水平。 反應(yīng)結(jié)束后,用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)450 nm(SOD)和530 nm(MDA)處的吸光度值,并根據(jù)預(yù)制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算單位重量(mg)蛋白含量的SOD 活性和MDA 水平,表示為 U/mg 蛋白(SOD) 和 nmol/mg 蛋白(MDA)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 葛根素對(duì)輻射下的空腸病理形態(tài)學(xué)改變的影響

如圖1 所示,對(duì)照組絨毛排列整齊且較長(zhǎng)(圖1A、1J),在絨毛底部有大量隱窩(圖1D、1K)且隱窩內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)正常(圖1D、1L)和基底層正常(圖1G);與對(duì)照組比較,單純輻射組絨毛排列紊亂且長(zhǎng)度明顯縮短(P<0.001)(圖1B、1J)、隱窩數(shù)明顯減少(P<0.01)(圖1E、1K)且隱窩內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.001)(圖 1E、1L)和基底層增厚(圖1H);與單純輻射組比較,輻射+葛根素組絨毛排列趨向整齊且長(zhǎng)度明顯增加(P<0.01)(圖1C、1J)、隱窩數(shù)明顯增加(P<0.01)(圖1F、1K)且隱窩內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)(圖1F、1L)和基底層變薄(圖1I)。

圖1 葛根素改善輻射造成的空腸病理學(xué)改變Note. A-I, Representative HE staining images in various groups. J-L, Statistical results of villus length (J), crypt count (K) and goblet cell count in crypt (L). n= 8. Compared with control (Con) group,##P<0.01,###P<0.001. Compared with radiation (RT) alone group,**P<0.01.Figure 1 Puerarin improves the pathological changes of jejunum caused by radiation

2.2 葛根素對(duì)輻射下空腸中Ki-67 分布與表達(dá)的影響

如圖2A 顯示,對(duì)照組大多數(shù)隱窩中觀察到弱的K-i67 染色;單純輻射組僅有少部分隱窩顯示少量K-i67 陽(yáng)性染色;輻射+葛根素組顯示大量隱窩中有較強(qiáng)的Ki-67 染色。 與對(duì)照組比較,單純輻射組空腸中Ki-67 表達(dá)明顯降低(P<0.001);與單純輻射組比較,輻射+葛根素組空腸中Ki-67 表達(dá)明顯增加(P<0.001),見圖2B。

圖2 葛根素促進(jìn)輻射下空腸組織中Ki-67 表達(dá)并改善其分布Note. A, Representative immunohistochemical staining images of Ki-67 in various groups. B, Relative gray values of Ki-67 expression. n= 8. Compared with control (Con) group, ###P<0.001. Compared with radiation (RT) alone group,***P<0.001.Figure 2 Puerarin promotes the expression and improves the distribution of Ki67 in jejunum tissues under radiation

2.3 葛根素對(duì)輻射下空腸絨毛中PECAM1 分布與表達(dá)的影響

如圖3A 顯示,對(duì)照組顯示絨毛上皮細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)正常,顯示單個(gè)柱狀完整上皮(即:PECAM1只在上皮細(xì)胞中大量表達(dá));單純輻射組顯示絨毛上皮結(jié)構(gòu)破壞、上皮細(xì)胞大量丟失,且上皮細(xì)胞滲入固有層(即:上皮細(xì)胞標(biāo)記物PECAM1 在固有層表達(dá));輻射+葛根素組顯示絨毛上皮結(jié)構(gòu)趨向正常,上皮細(xì)胞數(shù)增多,滲入固有層中的上皮細(xì)胞數(shù)降低(即:固有層中PECAM1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少)。 與對(duì)照組比較,單純輻射組空腸中PECAM1 表達(dá)明顯降低(P<0.001);與單純輻射組比較,輻射+葛根素組空腸中PECAM1 表達(dá)明顯增加(P<0.001),見圖3B。

圖3 葛根素改善輻射誘發(fā)的空腸絨毛上皮結(jié)構(gòu)紊亂Note. A, Representative immunohistochemical staining images of PECAM1 in various groups. B, Relative gray values of PECAM1 expression. n = 8. Compared with control (Con) group,###P<0.001. Compared with radiation (RT) alone group,***P<0.001.Figure 3 Puerarin improves the structure disorder of villous epithelium in jejunum induced by radiation

2.4 葛根素對(duì)輻射所致腸粘膜損傷的影響

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,單純輻射組空腸中Claudin-1(圖4A、4B)和ZO-1(圖4A、4C)蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.001);與單純輻射組比較,輻射+葛根素組空腸中 Claudin-1(圖4A、4B)和 ZO-1(圖4A、4C)蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.001)。 進(jìn)一步檢查了葛根素對(duì)輻射所致腸組織氧化應(yīng)激水平的影響,結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,單純輻射組空腸中SOD 活性明顯降低(圖4D)(P<0.001)和MDA 水平明顯升高(圖4E)(P<0.001);與單純輻射組比較,輻射+葛根素組空腸中SOD 活性明顯升高(圖4D)(P<0.001)和MDA 水平明顯降低(圖4E)(P<0.01)。

圖4 葛根素改善輻射所致腸粘膜損傷Note. A, Western blot band images of the expression of Claudin-1 and ZO-1 proteins in various groups. B, Relative expression level of Claudin-1 protein. C, The relative expression level of ZO-1 protein. D,SOD activity. E,MDA level. n=8. Compared with control(Con) group,###P<0.001. Compared with radiation (RT) alone group,**P<0.01,***P<0.001.Figure 4 Puerarin improves intestinal mucosal damage caused by radiation

3 討論

盡管放療能使腫瘤患者獲益,但放療造成的正常組織損傷也不可忽視,并且,放療損傷也是制約腫瘤放療效果的主要問(wèn)題之一[14]。 腸道對(duì)輻射高度敏感,胸、腹部和全身放療均有可能引起腸道放療綜合癥的發(fā)生[2-3]。 因此,緩解放療造成的腸道粘膜損傷,不僅能減少放療的腸道副作用,還可能增加腫瘤患者序貫放療的治療效果。 雖然,目前臨床針對(duì)防治放療造成的腸道損傷的藥物頗多,但總體效果并不令人滿意[15]。 因此,目前急需開發(fā)針對(duì)輻射后腸損傷新的有效的藥物。

天然中草藥提取物因效果顯著且毒副作用低,引起了眾多研究者的注意。 葛根素是從葛根的根莖中提取的具有藥理活性的化合物[9],因其具有安全有效性而被臨床廣泛用作代謝性、炎癥性和心血管疾病的替代藥物[10-12]。 且先前的研究[13]表明,葛根素對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的全身電離輻射損傷具有保護(hù)作用,但具體機(jī)制并不清晰且研究指標(biāo)偏少,很多作用并不明確。 另外大量研究[16-17]提示,葛根素還具有潛在的抗腫瘤效應(yīng)。 因此,推測(cè)葛根素可能是潛在的抗輻射損傷的優(yōu)良防護(hù)劑。 因此,本研究進(jìn)一步細(xì)致的觀察葛根素對(duì)輻射造成的腸道損傷的影響并分析了其潛在的機(jī)制。 本研究結(jié)果顯示,葛根素能增加輻射條件下的空腸組織的絨毛長(zhǎng)度和隱窩數(shù),并減少了隱窩中杯狀細(xì)胞的密度。 為進(jìn)一步解釋葛根素能減少輻射造成空腸隱窩丟失的原因,本研究用免疫組化檢測(cè)了空腸中增殖標(biāo)志物Ki-67 的表達(dá)和分布。 由于腸干細(xì)胞和增殖性隱窩細(xì)胞位于隱窩[18]中,因此本研究通過(guò)隱窩中Ki-67 的表達(dá)來(lái)評(píng)估腸受損后的再填充活性,結(jié)果顯示,葛根素治療后,大量隱窩中有較強(qiáng)的Ki-67 表達(dá),提示葛根素能促進(jìn)輻射損傷的空腸的隱窩細(xì)胞再生。另外,本研究還利用PECAM1 標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞觀察了葛根素對(duì)輻射造成空腸絨毛上皮結(jié)構(gòu)紊亂的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),葛根素能維持輻射條件下絨毛上皮結(jié)構(gòu),降低絨毛上皮損傷并減少絨毛上皮細(xì)胞丟失。以上結(jié)果充分顯示了,葛根素能改善輻射造成的腸粘膜病理形態(tài)改變,保護(hù)絨毛外在和內(nèi)在結(jié)構(gòu)完整性和減少輻射造成的隱窩丟失并促進(jìn)隱窩再生,促進(jìn)損傷后黏膜恢復(fù)。

TJ 蛋白是細(xì)胞旁通透性的主要決定因素,它反映了組織中TJ 的完整性[18]。 腸損傷會(huì)導(dǎo)致腸內(nèi)TJ蛋白的表達(dá)和分布發(fā)生變化,這也被稱為功能性TJ(屏障功能)缺陷,且屏障完整性的喪失的最主要的特征正是TJ 的蛋白分解[18-21]。 有研究發(fā)現(xiàn),X 射線誘發(fā)的大鼠回腸損傷后腸屏障功能減退主要體現(xiàn)在輻射導(dǎo)致 TJ(Claudin-1 和 ZO-1)的破壞[19]。本研究結(jié)果也體現(xiàn)了輻射后造成空腸Claudin-1 和ZO-1 表達(dá)降低,提示輻射造成腸屏障功能減退,使得腸道黏膜通透性增加;而葛根素能顯著恢復(fù)輻射誘導(dǎo)的Claudin-1 和ZO-1 蛋白表達(dá)的降低,這進(jìn)一步證實(shí)了葛根素對(duì)輻射誘導(dǎo)的腸損傷的保護(hù)作用。氧自由基的破壞是輻射引起的組織損傷的重要機(jī)制,MDA 水平和SOD 活性是組織過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)[22]。 本研究發(fā)現(xiàn)大鼠腹部輻射后,空腸組織MDA 水平升高,而SOD 活性顯著下降,提示輻射造成腸道過(guò)氧化應(yīng)激損傷;而葛根素治療能增加空腸組織SOD 活性,并降低MDA 水平,提示葛根素能降低輻射造成腸道氧化應(yīng)激損傷。 因此,葛根素減少氧化的作用可能在抑制輻射誘發(fā)的腸損傷和改善生存優(yōu)勢(shì)方面起重要作用。

這項(xiàng)研究表明葛根素可以通過(guò)促進(jìn)TJ 蛋白(Claudin-1 和ZO-1)表達(dá)而維持腸道屏障完整性、減少氧化應(yīng)激損傷、促進(jìn)隱窩細(xì)胞再生和維持腸絨毛上皮結(jié)構(gòu)完整性的作用來(lái)保護(hù)大鼠免受輻射誘發(fā)的腸道損傷。 因此,葛根素可能是預(yù)防輻射誘發(fā)的腸道損傷的有希望的候選藥物。