VEGF在綿羊卵巢中的表達(dá)分布研究

柴雅靜，余曉雪，楊 琨,2*，喬自林,2,3

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心/甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心/生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030）

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）又稱為促血管因子（vascul-otropin，VAS），它對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分裂等起到促進(jìn)作用，可以使血管對(duì)一些大分子物質(zhì)的通透性增強(qiáng)，刺激新血管生成，在生殖過(guò)程中也具有獨(dú)特作用[1-3]。形態(tài)學(xué)研究證明，卵泡的發(fā)育和血管的發(fā)生是密不可分的。卵泡周圍的血管網(wǎng)越密集，卵泡可吸收的營(yíng)養(yǎng)就越多，發(fā)育就越快。反之，發(fā)育受阻形成閉鎖卵泡[4]。

該實(shí)驗(yàn)以綿羊卵巢為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)HE染色和免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在綿羊卵巢中的表達(dá)及定位的特異性，為綿羊卵巢的卵泡發(fā)育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

該實(shí)驗(yàn)所需材料為綿羊的卵巢，于甘肅省蘭州市屠宰場(chǎng)采集健康綿羊卵巢組織樣本，經(jīng)宰割后立即采取組織樣本并放入4%多聚甲醛中固定。

1.2 材料處理

按照石蠟包埋的常規(guī)方法先取綿羊卵巢組織中的卵泡，對(duì)其形狀修整后進(jìn)行石蠟包埋，切成厚度為4～5 μm的組織切片，最后對(duì)切片進(jìn)行HE染色以及免疫組織化學(xué)染色。

1.3 主要試劑

兔SP試劑盒（SP-0023）、VEGF多克隆抗體（兔）（bs-1665R）以及DAB染色試劑盒（C02-04001），均購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 HE染色

將已經(jīng)固定好的卵巢組織用水沖洗、梯度脫水、透明后進(jìn)行浸蠟包埋，制作組織切片，然后進(jìn)行脫蠟水化、染色、分化、脫水透明、封片等HE常規(guī)染色步驟。鏡下觀察綿羊卵巢組織結(jié)構(gòu)的完整性及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1.5 免疫組織化學(xué)SP染色

將組織切片脫蠟水化，隨后抗原修復(fù)、阻斷、封閉，而后滴加一抗置于濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜孵育，PBS緩沖液洗滌后用二抗孵育。配置DAB顯色液進(jìn)行顯色并觀察，顯色終止后用蘇木精進(jìn)行復(fù)染，封片鏡檢。

1.6 結(jié)果判定

鏡檢結(jié)果中，DAB顯色陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色，通過(guò)棕黃色表達(dá)的深淺及面積可判斷VEGF表達(dá)的強(qiáng)弱。

2 結(jié)果

2.1 綿羊卵巢的組織學(xué)結(jié)構(gòu)

圖1A可見(jiàn)初級(jí)卵泡，結(jié)構(gòu)完好，初級(jí)卵母細(xì)胞與卵泡細(xì)胞之間有透明帶，卵泡周圍有卵泡膜[5]。圖1B可見(jiàn)次級(jí)卵泡，卵泡細(xì)胞間出現(xiàn)腔隙（卵泡腔），可見(jiàn)卵丘[6,7]。由此可知，該綿羊卵巢結(jié)構(gòu)完好，發(fā)育健康良好，無(wú)不良病變。

圖1 綿羊卵巢組織HE染色結(jié)果

2.2 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在綿羊卵巢中的表達(dá)

在綿羊卵巢中，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示VEGF主要在各級(jí)卵泡中表達(dá)。由圖2可知，VEGF在原始卵泡、初級(jí)卵泡以及次級(jí)卵泡中都為陽(yáng)性表達(dá)。由表達(dá)的深淺不同可知，VEGF在次級(jí)卵泡中表達(dá)最強(qiáng)，初級(jí)卵泡中表達(dá)效果次之，原始卵泡中表達(dá)最弱，且VEGF主要在初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞以及卵泡膜細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，在細(xì)胞核內(nèi)無(wú)表達(dá)。

圖2 綿羊卵巢免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果

3 討論

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是關(guān)于血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。血管在卵泡發(fā)育初期就開(kāi)始生成，且在整個(gè)卵泡發(fā)生過(guò)程中是持續(xù)的。卵巢中卵泡的發(fā)育可分為籌募、選擇和優(yōu)勢(shì)化3個(gè)過(guò)程。在卵泡優(yōu)勢(shì)化時(shí)期，高表達(dá)量的VEGF會(huì)促進(jìn)血管的生成，給正在發(fā)育的卵泡提供更為豐富的營(yíng)養(yǎng)，使卵泡更加快速地生長(zhǎng)發(fā)育[8]。

排卵前，卵泡的膜細(xì)胞層中會(huì)形成大量血管，由于VEGF的表達(dá)強(qiáng)度與卵泡中的血管生成和發(fā)育有著密切關(guān)聯(lián)[9]，因此可推測(cè)本研究結(jié)果中顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞分泌的VEGF可能促進(jìn)了膜細(xì)胞層血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。

1999年，Otani[9]等人通過(guò)免疫組織化學(xué)方法研究證實(shí)，在人的卵泡中VEGF是存在免疫定位的。VEGF在小腔卵泡的顆粒細(xì)胞中表達(dá)較弱，在中型卵泡的膜細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)，其顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度會(huì)隨著卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育逐漸增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為VEGF在綿羊卵巢中的表達(dá)主要分布于各級(jí)卵泡，其中在竇腔期卵泡中的表達(dá)比原始卵泡中多，且VEGF主要在顆粒細(xì)胞以及卵泡膜細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)。

4 結(jié)語(yǔ)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在綿羊卵巢中的表達(dá)主要位于顆粒細(xì)胞以及卵泡膜細(xì)胞的胞質(zhì)中，細(xì)胞核內(nèi)無(wú)VEGF表達(dá)，推測(cè)顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞分泌的VEGF可能促進(jìn)了膜細(xì)胞層血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，能夠?yàn)榫d羊的繁殖機(jī)理及其卵泡發(fā)育的調(diào)控提供理論參考。