膠質(zhì)纖維酸性蛋白在新疆哈薩克羔羊腸道內(nèi)的分布研究

彭凡洋，冷青文

（石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003）

膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的主要IF蛋白[1]，能夠維持神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及信息傳遞等活動[2]。GFAP的表達(dá)量與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖分化有關(guān)。正常狀態(tài)下，GFAP免疫反應(yīng)受星形膠質(zhì)細(xì)胞的動力調(diào)節(jié)[3]；當(dāng)機(jī)體遭受損傷后，GFAP的表達(dá)能促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞增生。成熟的腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（enteric glial cells，EGCs）內(nèi)GFAP的表達(dá)水平與外界損傷刺激以及EGCs的功能狀態(tài)密切相關(guān)[2]。因此，GFAP被認(rèn)為是EGCs活化的標(biāo)記物[4]。

EGCs是腸神經(jīng)傳遞和處理信息的中心，其含有神經(jīng)遞質(zhì)前體，并且能夠表達(dá)神經(jīng)遞質(zhì)受體。此外，EGCs能夠維持黏膜屏障的完整性，對IEC的生長調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。在基因修飾的小鼠模型中，切除腸膠質(zhì)細(xì)胞基因的小鼠暴發(fā)了由腸上皮屏障破壞引起的急性腸道炎癥[5-7]。研究表明[8]，來自正常小鼠黏膜的腸膠質(zhì)細(xì)胞能夠表達(dá)神經(jīng)激肽A和SP，兩者都可能作用于免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞。由此可見，EGCs能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子與其他免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的非特異性黏膜防御功能[9]。

近年來，EGCs在調(diào)節(jié)腸道健康和慢性疾病上發(fā)揮了重要作用，已成為科研人員的研究熱點。本試驗通過觀察新疆哈薩克羔羊腸道中GFAP的分布特征，為綿羊EGCs的分布與功能提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗選取9只3月齡的新疆哈薩克羔羊，雌雄不限，平均體重21.2 kg/只。用抹脖法放血屠宰，迅速剖開腹腔，分別切取十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸1～2 cm組織塊，用0.9%生理鹽水漂洗，再置于4%多聚甲醛固定液（0.1 mol/L，pH7.2）中固定24 h。常規(guī)石蠟包埋，制備連續(xù)切片，厚度5 μm，干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

免疫組化（IHC）試劑盒套裝（抗兔）；GFAP兔單克隆抗體；生物素標(biāo)記羊抗兔IgG抗體；試劑均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

免疫組化SABC-DAB染色按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，石蠟切片脫蠟水化，用0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。置于檸檬酸鹽抗原修復(fù)緩沖液中用微波爐熱修復(fù)，冷卻至室溫后取出。在室溫下用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育30 min。切片用山羊血清37℃封閉20 min。擦干切片上多余液體，滴加一抗（1∶500）后切片于濕盒37℃孵育1～2 h，同時用PBS緩沖液作一抗的陰性對照組，0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG后切片于濕盒37℃孵育20 min，用0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。滴加SABC試劑后切片于濕盒37℃孵育20 min，用0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。DAB顯色：顯微鏡下控制時間，暗處反應(yīng)3～5 min，水洗；用蘇木精復(fù)染1～5 min，水洗，置于溶液中脫水透明后用中性樹脂封片。在光學(xué)顯微鏡（×100）下鏡檢，并用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0拍照分析。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果描述為細(xì)胞著色無、弱（淡黃）、中（棕黃）、強(qiáng)（棕褐）四級。

2 結(jié)果

2.1 GFAP在哈薩克羔羊小腸中的分布特點

GFAP在哈薩克羔羊小腸中的分布見圖1。由圖1A可知，GFAP在十二指腸黏膜上皮層呈不規(guī)則的團(tuán)塊狀分布，為強(qiáng)陽性；在黏膜固有層呈陽性分布；在固有肌層呈點狀分布，為弱陽性。由圖1B可知，GFAP在空腸黏膜上皮層呈片狀分布，為強(qiáng)陽性；在黏膜固有層也呈強(qiáng)陽性分布；在固有肌層呈點狀分布，為弱陽性。由圖1C可知，GFAP在回腸黏膜上皮層呈強(qiáng)陽性分布；在黏膜固有層也呈強(qiáng)陽性分布；在固有肌層呈弱陽性分布。

圖1 GFAP在小腸各段的表達(dá)

2.2 GFAP在哈薩克羔羊大腸中的分布特點

GFAP在哈薩克羔羊大腸中的分布見圖2。由圖2D可知，GFAP在盲腸黏膜上皮層呈不規(guī)則的片狀分布，為強(qiáng)陽性；在黏膜固有層呈強(qiáng)陽性分布；在固有肌層呈點狀分布，為弱陽性。由圖2E可知，GFAP在結(jié)腸黏膜上皮層呈強(qiáng)陽性分布；在黏膜固有層呈不連續(xù)的片狀分布，為強(qiáng)陽性；在固有肌層呈弱陽性分布。由圖2F可知，GFAP在回腸黏膜上皮層呈強(qiáng)陽性分布；在黏膜固有層也呈強(qiáng)陽性分布；在固有肌層呈弱陽性分布。

圖2 GFAP在大腸各段的表達(dá)

2.3 GFAP在哈薩克羔羊各個腸段的光密度值比較

比較GFAP在哈薩克羔羊腸道各個腸段的OD值，結(jié)果見圖3。在羔羊小腸中，十二指腸GFAP的OD值最大，空腸與回腸次之；在羔羊大腸中，結(jié)腸GFAP的OD值最大，直腸與盲腸次之；羔羊小腸的GFAP的OD值顯著高于大腸（P＜0.05）。

圖3 哈薩克羔羊腸道GFAP的平均光密度

3 討論

GFAP由432個氨基酸構(gòu)成，相應(yīng)的分子量為49.8 kDa，是一種不溶性的單體蛋白[10]。在腸道中，GFAP被認(rèn)為是成熟EGCs的標(biāo)記物[11]。越來越多的研究表明，EGCs分泌的GFAP可以調(diào)節(jié)腸道屏障功能。Costantini等[12]發(fā)現(xiàn)，通過刺激表達(dá)GFAP可以預(yù)防小鼠的回腸通透性增加。用藥物治療EGCs誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，可以降低EGCs中GFAP的表達(dá)，并且減輕小鼠的炎癥反應(yīng)[13]。研究表明，IBD患者腸道的GFAP表達(dá)顯著上升[14-16]。因此，GFAP的表達(dá)量在一定意義上反映了EGCs的損傷程度。

本研究發(fā)現(xiàn)，在新疆哈薩克羔羊腸道中，GFAP在各個腸段均有陽性反應(yīng)，且主要表達(dá)于小腸段，表明在羔羊腸道中EGCs不僅分布廣泛，而且可能參與調(diào)節(jié)羔羊腸道的分泌和吸收功能。EGCs是腸神經(jīng)系統(tǒng)的主要成分，與腸神經(jīng)結(jié)構(gòu)緊密相連，并且分布在不同的腸道層內(nèi)[17]。它具有抗原提呈作用，協(xié)同抗原激活腸道細(xì)胞免疫系統(tǒng)反應(yīng)[18]，改善腸黏膜屏障功能。羔羊腸道中EGCs的分布特點可能與腸黏膜屏障的功能有關(guān)，本研究結(jié)果表明，GFAP在羔羊腸道黏膜上皮層和黏膜固有層呈強(qiáng)陽性分布，在固有肌層呈弱陽性分布，表明EGCs可能既參與羔羊腸道的消化吸收功能，又參與腸道屏障的免疫反應(yīng)。劉敬賢等[19]研究發(fā)現(xiàn)，脊髓受損的大鼠用IL-1β干預(yù)后，信號通路JAK2-STAT3被活化，體內(nèi)GFAP和微支肽表達(dá)上升。而IL-6可對STAT3磷酸化施以調(diào)控，同時結(jié)合GFAP基因啟動子，加速體內(nèi)神經(jīng)元以及EGCs的增殖[20]。由此可知，EGCs除了能支持腸神經(jīng)元外，還能促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，緩解腸道炎癥，增強(qiáng)機(jī)體的腸黏膜屏障功能。

4 結(jié)論

GFAP在新疆哈薩克羔羊的各個腸段中均有分布，以小腸為主；在羔羊的腸黏膜上皮層和黏膜固有層呈強(qiáng)陽性分布，在固有肌層呈弱陽性分布；EGCs在羔羊腸道中的分布范圍廣泛，可能參與調(diào)節(jié)腸道的諸多生理功能。