軟棗獼猴桃復合酵素飲料的發(fā)酵及抗氧化活性研究

王虹玲，丁昊，安東平，汪琢，馬爽，王家慶

（沈陽工學院生命工程學院，遼寧 撫順 113122）

軟棗獼猴桃是獼猴桃科、獼猴桃屬大型落葉藤本植物，分布廣泛，物種資源豐富，是一種珍貴的經(jīng)濟果樹，在食品和保健品領域具有良好的開發(fā)前景[1-2]。隨著近幾年關于軟棗獼猴桃的研究越來越多，其中的生物活性成分不斷被開發(fā)出來，主要有多酚類、蒽醌類和多糖類化合物。 軟棗獼猴桃中的多酚類物質可以賦予人體較強的抗氧化能力，現(xiàn)有研究主要集中在軟棗獼猴桃功能活性物質的提取和衍生食品的加工[3]，將軟棗獼猴桃加工成老少皆宜的復合酵素飲料是一種有效提升農(nóng)產(chǎn)品附加值的手段。

水果酵素飲料是指果蔬在多種有益菌的自然條件下發(fā)酵產(chǎn)出的富含酶、多種維生素、礦物質和次生代謝產(chǎn)物等功能成分的發(fā)酵飲品。酵素飲料在海外已被大眾所認同，根據(jù)已有的學術報道，酵素飲料具有抑菌、抗氧化、改善腸道菌群等功效[4]，有利于人體健康。

目前，對于水果酵素飲料的研究較多，研究方向主要集中在生產(chǎn)工藝和功能作用領域。 如郭偉峰等[5]以超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力為指標，優(yōu)化了利用乳酸桿菌發(fā)酵桑葚果汁制備桑葚酵素飲料的工藝； 寧楚潔等以總酸和DPPH 自由基清除率為指標，利用響應面試驗方法優(yōu)化玉米須果蔬復合飲料制備工藝，且產(chǎn)品對DPPH 自由基具有較強的清除作用[6]。 本研究以軟棗獼猴桃、百香果和寒富蘋果為主要原料，借助響應面試驗方法研究了復合酵素飲料的生產(chǎn)工藝，考察發(fā)酵前后DPPH 自由基、羥自由基、ABTS+自由基清除能力等指標并與抗壞血酸進行對比評價其抗氧化活性[7-8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃、寒富蘋果、百香果：市售；葡萄酒酵母：安琪酵母股份有限公司；復合乳酸菌（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌）：河北一然生物科技有限公司。

白砂糖：太古糖業(yè)有限公司；檸檬酸：河南萬邦實業(yè)有限公司；抗壞血酸（分析純）：卡而銘商貿有限公司；DPPH（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、鄰苯三酚、過氧化氫、硫酸亞鐵（分析純）：國藥化學試劑廠；總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS 法）：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

FA1104 電子天平： 東陽市英衡智能設備有限公司；VD650 超凈工作臺：浙江蘇珀儀器設備有限公司；LDZX-50KBS 立式高壓蒸汽滅菌鍋： 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；DHP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；TD-45/TD-92 手持糖度計：深圳市速維電子科技有限公司；ST2100/B pH 計：上海越平精密儀器設備有限公司。

1.3 軟棗獼猴桃復合果蔬飲料的工藝流程

水果原料→無菌條件下清洗、去皮、切塊（片）→平鋪于發(fā)酵罐→接種復合發(fā)酵劑→過濾除菌→低溫無菌灌裝→成品

1.3.1 原料預處理

選擇大小均一且無外部損傷的等質量軟棗獼猴桃、寒富蘋果和百香果，在超凈工作臺上用無菌水清洗并切片（塊）。 發(fā)酵過程所使用的器皿和發(fā)酵罐均用高壓滅菌鍋充分滅菌。

1.3.2 酵素飲料的制備

將軟棗獼猴桃、寒富蘋果及百香果與白砂糖按照2∶1（質量比）平鋪于已滅菌的發(fā)酵罐中，重復碼放至7分或8 分滿。

1.3.3 接種與發(fā)酵

取適量無菌水與乳酸菌-葡萄酒酵母復合發(fā)酵劑（1∶1）混合，再加入等質量的葡萄糖，置于35 ℃條件下活化30 min。待活化完全后倒入發(fā)酵罐，置于適宜的溫度下發(fā)酵1～3 個月，直到無氣體產(chǎn)生，pH 值為2～4，即發(fā)酵中止。 即得天然發(fā)酵的水果酵素[9]。

1.4 單因素試驗

選取發(fā)酵時間30、40、50、60、70 d， 發(fā)酵溫度26、28、30、32、34 ℃以及乳酸菌-葡萄酒酵母復合發(fā)酵劑接種量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%為單因素， 以產(chǎn)品總酸含量為評價指標進行單因素試驗。

1.5 Box-Behnken 試驗設計

依據(jù)單因素試驗的結果選取合適的水平，并且以產(chǎn)品總酸含量為響應值，利用Design-Expert8.0.6 軟件的Box-Benhnken 試驗設計原理進行三因素三水平的響應面試驗[10]，因素水平如表1 所示。

表1 Box-Benhnken 試驗因素水平Table 1 Factor levels in Box-Benhnken test

1.6 酵素飲料的調配

發(fā)酵后的軟棗獼猴桃復合飲料經(jīng)過濾、離心后加入一定量的檸檬酸和白砂糖以平衡糖酸比和口感，進行全因子試驗以達到最適的口感和風味。 全因子試驗方案和感官評價標準如表2、表3 所示。

表2 全因子試驗水平Table 2 Full factor test level

表3 軟棗獼猴桃復合酵素飲料感官評價指標Table 3 Sensory evaluation index for Actinidia arguta complex ferment beverage

1.7 酵素飲料理化指標的測定

軟棗獼猴桃復合酵素飲料的總酸含量采用GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的滴定法測定；pH 值采用GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH 值的測定》中的pH 計法測定；可溶性固形物含量采用GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中的折光法測定。

1.8 酵素飲料微生物指標的測定

微生物指標主要有大腸菌群、霉菌、酵母菌和菌落總數(shù)。 大腸菌群采用GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》測定；霉菌和酵母菌計數(shù)采用GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母菌計數(shù)》測定；菌落總數(shù)采用GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》測定。

1.9 自由基清除率的測定

1.9.1 DPPH 自由基清除率的測定

取軟棗獼猴桃酵素復合飲料2 mL 轉移到10 mL的試管中， 再加入2 mL 濃度為2×10-4mol/L 的DPPH-80%乙醇水溶液，充分混勻后，靜置0.5 h，用80%乙醇溶液調零，在517 nm 處測其吸光度，記為A1；將DPPH溶液和80%乙醇溶液各2 mL 混勻后， 相同條件下測其吸光度為A0； 將樣品和80%乙醇溶液各2 mL 混勻后，相同條件下測其吸光度為A2，重復3 次試驗。 DPPH自由基清除率用以下公式計算[11-12]。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1－A2）/A0]×100

式中：A0為2 mL 的DPPH 溶液和2 mL 80%的乙醇混合液的吸光度；A1為2 mL DPPH-80%乙醇水溶液和2 mL 樣品液的吸光度；A2為2 mL 樣品液與2 mL的80%乙醇混合溶液的吸光度。

1.9.2 ABTS+自由基清除能力的測定

ABTS+自由基清除能力采用試劑盒中說明書標注的方法進行測定，并根據(jù)已知的標準曲線計算該指標。

1.9.3 羥自由基清除率的測定

在0.45 mL 樣品中加水定容至2 mL， 然后添加6 mmol/L 的過氧化氫1.4 mL、20 mmol/L 的水楊酸鈉0.6 mL 和2 mL 濃度為1.5 mmol/L 的FeSO4·7H2O，最后置于37 ℃環(huán)境中水浴60 min。 蒸餾水進行調零，在760 nm 處對樣品的吸光度A 進行測量， 重復次數(shù)為3次[13-14]。 羥自由基清除率用下列公式進行計算。

羥自由基清除率/%=[（A1－A2）/A1]×100式中：A1為空白的平均吸光度；A2為樣品液的平均吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵時間對產(chǎn)品總酸含量的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時間對產(chǎn)品總酸含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on total acid content of products

由圖1 可知， 軟棗獼猴桃復合酵素飲料發(fā)酵時間在60 d 時總酸含量最高（4.08 g/L），總酸含量可以反映酵素飲料發(fā)酵體系進行的程度，0～60 d 內體系發(fā)酵程度逐漸增加，積累初級代謝產(chǎn)物。 而在60 d 后反應體系中的各種有機酸被轉化成次級代謝產(chǎn)物，這是由于在發(fā)酵初期菌種大量繁殖，而在發(fā)酵一段時間后菌種逐漸沉淀，因此發(fā)酵時間為60 d 時的酵素飲料發(fā)酵最完全。

2.1.2 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對產(chǎn)品總酸含量的影響見圖2。

由圖2 可知，當發(fā)酵溫度低于28 ℃時發(fā)酵體系中代謝產(chǎn)物積累緩慢，當發(fā)酵溫度高于28 ℃后反應速度加快，產(chǎn)物合成增多。 當發(fā)酵溫度大于30 ℃后體系溫度不利于微生物代謝，酵母菌與乳酸菌生長受到抑制導致體系總酸含量降低。 因此軟棗獼猴桃復合酵素飲料最適的發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對產(chǎn)品總酸含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on total acid content of products

2.1.3 復合發(fā)酵劑接種量的確定

復合發(fā)酵劑接種量對產(chǎn)品總酸含量的影響見圖3。

圖3 復合發(fā)酵劑接種量對產(chǎn)品總酸含量的影響Fig.3 Effect of compound starters inoculum amount on total acid content of products

由圖3 可知，當復合發(fā)酵劑接種量小于1.5%時總酸積累速率較慢，而當復合發(fā)酵劑接種量大于1.5%時體系總酸含量趨于穩(wěn)定且增速放緩。 考慮到實際發(fā)酵控制和生產(chǎn)成本兩個因素，選擇1.5%為最適的復合發(fā)酵劑接種量，此時總酸含量為3.31 g/L。

2.2 Box-Behnken 試驗設計結果

響應面法優(yōu)化軟棗獼猴桃復合酵素飲料的發(fā)酵工藝結果如表4 所示。

2.3 二次回歸方程的擬合及響應面分析與方差分析

對表4 中的響應值進行多元回歸擬合分析，確立如下回歸方程：Y=3.71+0.08A+0.08B+0.065C+0.075AB+0.03AC+0.04BC-0.16A2-0.17B2-0.14C2。 方差分析結果見表5。

表4 軟棗獼猴桃復合酵素飲料Box-Behnken 試驗設計結果Table 4 Results of Box-Behnken design of Actinidia arguta complex ferment beverage

由表5 結果可知，模型極顯著，失擬項不顯著，相關系數(shù)R2=0.990 6， 調整系數(shù)R2adj=0.978 5， 變異系數(shù)（CV）=0.75%。 以上數(shù)據(jù)表明了該模型擬合性較好，重現(xiàn)性穩(wěn)定。 顯著性檢驗表明，在所取的各因素范圍內，影響軟棗獼猴桃復合酵素飲料發(fā)酵工藝條件的主次順序為A（發(fā)酵時間）=B（發(fā)酵溫度）＞C（復合發(fā)酵劑接種量）。 其中一次項A、B 和C， 交互項AB 和二次項A2、B2和C2對軟棗獼猴桃復合酵素飲料發(fā)酵工藝的影響均為極顯著（P＜0.01）， 交互項BC 影響顯著（P<0.05）。

表5 響應面試驗方差分析Table 5 Response surface test analysis of variance

響應面分析結果見圖4。

響應面分析圖可直觀地看出各因素的交互作用對產(chǎn)品感官評分的影響，曲面越陡峭則說明該因素對響應值的結果影響越大。 由圖4 可知，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和復合發(fā)酵劑接種量兩兩相互作用對產(chǎn)品總酸含量的影響較為顯著。

圖4 因素交互效應對飲料總酸含量影響的響應面圖Fig.4 Response surface of interaction effects of factors on total acid content of beverage

2.4 酵素飲料發(fā)酵條件的驗證試驗

根據(jù)Design-Expert8.0.6 數(shù)學建模的優(yōu)化分析，得出軟棗獼猴桃復合飲料的最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間62 d、發(fā)酵溫度30.66 ℃、復合發(fā)酵劑接種量2.21%，預測總酸含量為3.747 9 g/L。為了方便實際生產(chǎn)，將工藝參數(shù)調整為：發(fā)酵時間62 d、發(fā)酵溫度30.6 ℃、復合發(fā)酵劑接種量2.2%，進行3 次重復試驗，測得平均總酸含量為3.78 g/L，與預測值接近，誤差值為0.86%，表明該模型在實踐中可行。

2.5 軟棗獼猴桃復合酵素飲料的調配結果

軟棗獼猴桃復合酵素飲料的調配試驗結果見表6。

表6 軟棗獼猴桃復合酵素飲料的調配試驗結果Table 6 Experimental results of preparation of Actinidia arguta complex ferment beverage

根據(jù)全因子試驗結果， 得出當白砂糖添加量為5%，檸檬酸添加量為0.04%時風味最佳，此時的產(chǎn)品色澤均一穩(wěn)定、果香濃郁、糖酸比適中。

2.6 軟棗獼猴桃復合酵素飲料的微生物指標

對優(yōu)化方案加工的軟棗獼猴桃復合酵素飲料進行微生物檢測顯示，微生物菌落總數(shù)5 CFU/mL；大腸桿菌及其它致病菌均未檢出，符合GB 7101—2015《食品安全國家標準飲料》中關于微生物的限量要求。

2.7 軟棗獼猴桃復合酵素飲料的理化指標

對優(yōu)化方案制備的軟棗獼猴桃復合酵素飲料進行理化檢驗，得到產(chǎn)品pH 值為2.86；產(chǎn)品總酸含量為3.78 g/L；產(chǎn)品可溶性固形物含量為11.23%。

2.8 發(fā)酵前后中酵素飲料體外抗氧化能力的變化

發(fā)酵前和按最優(yōu)發(fā)酵方式制備的軟棗獼猴桃復合酵素飲料的DPPH 自由基清除率、 羥自由基清除率和ABTS+自由基清除能力如表7 所示。

表7 發(fā)酵前后軟棗獼猴桃復合酵素飲料對產(chǎn)品不同自由基清除能力的變化Table 7 Changes of free radical scavenging ability of Actinidia arguta complex ferment beverage before and after fermentation

軟棗獼猴桃復合酵素飲料在發(fā)酵前后DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除能力均稍有下降，但是羥自由基清除能力有較明顯的上升，由發(fā)酵前的64.69%上升至72.15%，增幅達11.53%，且高于4 mg/mL 抗壞血酸的羥自由基清除能力，上述數(shù)據(jù)說明該酵素飲料具有良好的抗氧化效果。

3 結論

本試驗以軟棗獼猴桃、寒富蘋果及百香果為原料研制軟棗獼猴桃復合酵素飲料，在單因素試驗基礎上以總酸含量為響應值，以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和復合發(fā)酵劑接種量為考察因素，通過Box-Behnken 中心組合試驗原理進行響應面分析。 結果表明軟棗獼猴桃復合發(fā)酵飲料的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時間62 d、發(fā)酵溫度30.6 ℃、 乳酸菌-葡萄酒酵母復合發(fā)酵劑接種量2.2%，測得產(chǎn)品平均總酸含量為3.78 g/L。 并以感官評分為評價標準進行全因子試驗得出產(chǎn)品最佳調配工藝為：白砂糖添加量5%，檸檬酸添加量0.04%，以上工藝條件制備的產(chǎn)品色澤均一穩(wěn)定，口感清爽，富含果香，平均感官評分為96.54 分，相關微生物指標與理化指標符合相關國家標準。 同時該酵素飲料的DPPH 自由基清除率、 羥自由基清除率和ABTS+自由基清除能力較高。 該試驗為日后的酵素飲料研究和復合發(fā)酵劑研究提供了理論指導和實踐基礎。