不同手術(shù)時機(jī)肋骨環(huán)抱器手術(shù)對肋骨骨折大鼠預(yù)后影響的實驗研究

馬兵兵，王鵬國

(1.兵器工業(yè)五二一醫(yī)院心胸外科，陜西 西安 710065；2.陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

骨折是指骨的力學(xué)完整性遭到連續(xù)性中斷或破壞，同時伴有局部軟組織及血管的損傷。肋骨骨折為骨折的主要類型，也是比較嚴(yán)重的胸部損傷[1-2]。當(dāng)前隨著交通事故與工業(yè)受傷的發(fā)生頻率日益增高，肋骨骨折的發(fā)生率也隨之逐漸增加，已成為臨床上常見的創(chuàng)傷性疾病之一[3]。手術(shù)為肋骨骨折的主要治療方法，特別是當(dāng)前微創(chuàng)手術(shù)具有創(chuàng)傷小、恢復(fù)胸廓的完整性和穩(wěn)定性、復(fù)位穩(wěn)定可靠、消除骨折斷端的異常刺激等特點，但是也存在骨折愈合時間比較長等不足，為此在臨床上多需要進(jìn)行輔助治療[4]。其中肋骨環(huán)抱器是一種可彎曲塑形的并環(huán)抱固定肋骨的內(nèi)固定物，有利于快速固定肋骨骨折斷端，在合適的溫度下環(huán)抱器迅速恢復(fù)形狀，從而牢固固定肋骨骨折[5-6]。同時現(xiàn)代研究表明骨折的愈合是骨組織多種生理因子共同參與的修復(fù)過程，也是由神經(jīng)、體液共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，涉及到肉芽組織修復(fù)期、軟骨痂形成期、硬骨痂形成期、骨痂重塑期等，然后讓骨恢復(fù)原有結(jié)構(gòu)形態(tài)[7]。由于骨折手術(shù)治療過程中對骨組織生物學(xué)環(huán)境的改變，以及不同手術(shù)時機(jī)所導(dǎo)致的骨組織力學(xué)環(huán)境的變化可對骨折愈合產(chǎn)生一定的影響[8-9]。本研究具體探討了不同手術(shù)時機(jī)肋骨環(huán)抱器手術(shù)對肋骨骨折大鼠的預(yù)后，希望明確肋骨環(huán)抱器的應(yīng)用時機(jī)，為促進(jìn)肋骨骨折愈合提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級健康10周齡雄性SD大鼠購自南京君科生物工程有限公司[體重(200±20)g，飼養(yǎng)于本院實驗動物中心提供]，飼養(yǎng)條件：空氣相對濕度30%～40%，室溫(22±2)℃，自由攝食水，12 h間隔照明，每周2～3 次更換墊料。動物許可證號SYXK832913，本實驗符合本院動物保護(hù)委員會的要求。鈦鎳記憶合金環(huán)抱器購自泰州市宇杰醫(yī)療器械有限公司，純鈦爪形肋骨接骨板購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2 肋骨骨折模型的制備 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，10%的水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。大鼠取俯臥位，在大鼠左耳下緣約2.5 cm左右，距脊柱中線約1.5 cm處作為切口部位，依次切開皮膚、皮下組織和深筋膜，暴露并固定肋骨，用眼科剪剪斷成橫行骨折，然后逐層縫合關(guān)閉創(chuàng)口。

將建模成功的肋骨骨折大鼠(n=54)隨機(jī)平分為模型組、早期組與晚期組，根據(jù)肋骨橫徑、形狀及長度選擇合適的鎳鈦合金環(huán)抱器與純鈦爪形肋骨接骨板。早期組與晚期組分別在建模后1 d與3 d后將環(huán)抱器置于肋骨斷端，固定環(huán)抱器兩端，用45 ℃左右溫鹽水紗布握住放好的環(huán)抱器，環(huán)抱器可自動復(fù)原可固定在骨折處，消除反常呼吸、支撐塌陷的胸廓。模型組不進(jìn)行環(huán)抱器手術(shù)處理。

所有大鼠在建模與手術(shù)過程中分籠放置，注意大鼠保暖。

1.3 觀察指標(biāo) ①在術(shù)后第1周、第2周每組分別處死9只大鼠，以肋骨骨折區(qū)域為中心剪斷肋骨及其相鄰兩根肋骨，拍攝X線片，測定與記錄骨小梁寬度、骨小梁成骨指數(shù)。②對大鼠進(jìn)行眼窩采血，分為三管。第一管不抗凝，靜置30 min后3000 r/min 離心10 min，分離上層血清，采用酶聯(lián)免疫法檢測血清核因子kappaB受體活化因子配體(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)與血清中骨保護(hù)素(Osteoprotegerin,OPG)含量。第二管進(jìn)行抗凝，靜置30 min后3000 r/min離心10 min，分離上層血漿，采用全自動生化分析儀檢測血漿血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)含量。第三管進(jìn)行抗凝，靜置30 min后3000 r/min 離心10 min，分離下層全血細(xì)胞，采用流失細(xì)胞儀檢測CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞含量。③去除骨折肋骨周圍兩根肋骨，剔除表面附著肌肉等軟組織，在4%多聚甲醛溶液中固定，制成病理切片，觀察骨折愈合情況。

2 結(jié) 果

2.1 病理情況比較 所有大鼠在手術(shù)過程中都生命體征穩(wěn)定。模型組大量骨祖細(xì)胞及成纖維細(xì)胞分布在骨折區(qū)域，未見新生的骨小梁，大量炎細(xì)胞浸潤。早期組骨小梁融合成片，骨基質(zhì)形成，大量骨細(xì)胞沉積于骨基質(zhì)中。晚期組出現(xiàn)軟骨細(xì)胞及新生骨小梁，可見大量的成骨細(xì)胞與造血細(xì)胞灶。

2.2 三組術(shù)后不同時間點骨組織形態(tài)指標(biāo)比較 見表1。早期組與晚期組的術(shù)后第1周、第2周骨小梁寬度、骨小梁成骨指數(shù)都高于模型組(均P<0.05)，早期組高于晚期組(P<0.05)。

表1 三組術(shù)后不同時間點骨組織形態(tài)指標(biāo)比較

2.3 三組術(shù)后不同時間點血清RANKL與OPG含量比較 見表2。早期組與晚期組的術(shù)后第1周、第2周的血清RANKL含量低于模型組(均P<0.05)，血清OPG含量高于模型組(均P<0.05)，早期組與晚期組對比差異也都有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 三組術(shù)后不同時間點血清RANKL與OPG含量比較(pg/ml)

2.4 三組術(shù)后不同時間點血漿VEGF與BMP-2含量比較 見表3。早期組與晚期組的術(shù)后第1周、第2周的血漿VEGF與BMP-2含量高于模型組(均P<0.05)，早期組高于晚期組(P<0.05)。

表3 三組術(shù)后不同時間點血漿VEGF與BMP-2含量比較(pg/ml)

2.5 三組術(shù)后不同時間點CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比例比較 見表4。早期組與晚期組的術(shù)后第1周、第2周的CD4+T淋巴細(xì)胞比例高于模型組(均P<0.05)，早期組高于對照組(P<0.05)，三組不同時間點的CD8+T淋巴細(xì)胞比例對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表4 三組術(shù)后不同時間點CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比例比較(%)

3 討 論

肋骨骨折的發(fā)生，其在一定程度上可使局部胸壁失去完整肋骨支撐而軟化，導(dǎo)致出現(xiàn)連枷胸，也可出現(xiàn)反常呼吸運動，誘發(fā)機(jī)體出現(xiàn)血胸、氣胸等并發(fā)癥，嚴(yán)重情況下可導(dǎo)致機(jī)體死亡。肋骨骨折的常見臨床癥狀為局部疼痛，特別在咳嗽時疼痛更明顯[10]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展與手術(shù)內(nèi)固定器械的更新，手術(shù)治療肋骨骨折及糾正連枷胸取得了很好的效果。本研究顯示早期組與晚期組的術(shù)后第1周、第2周骨小梁寬度、骨小梁成骨指數(shù)都高于模型組(均P<0.05)，早期組高于晚期組(P<0.05)，表明肋骨環(huán)抱器早期手術(shù)在肋骨骨折大鼠的應(yīng)用能促進(jìn)骨折愈合。從機(jī)制上分析，鈦鎳合金是一種形狀記憶合金，其可利用鎳元素在溫度變化下的記憶特性，具有很好的可塑性，塑形完成后迅速固定至肋骨骨折斷端，從而牢固固定肋骨斷端[11]。而早期手術(shù)的應(yīng)用能盡早使得大鼠的胸廓畸形盡快恢復(fù)正常形狀，促使大鼠盡快恢復(fù)呼吸功能，促使骨折斷端骨膜內(nèi)出現(xiàn)成骨反應(yīng)，血管進(jìn)入軟骨骨痂，破骨細(xì)胞吸收鈣化軟骨[12-13]。

骨折的發(fā)生是一系列細(xì)胞和細(xì)胞因子相互作用，伴有大量的RANKL釋放，也會抑制OPG的釋放。骨折愈合的初期炎癥期，由于骨折局部為低pH值和高乳酸濃度環(huán)境，是影響骨折愈合的重要因素。特別是骨折術(shù)后早期血腫形成，標(biāo)志著炎性反應(yīng)的開始[14]。RANKL由活化的T細(xì)胞、成骨細(xì)胞分泌，與RANK結(jié)合后可激活下游通路的表達(dá)，從而促進(jìn)破骨前體細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞[15]。OPG 屬于腫瘤壞死因子受體家族成員，可競爭性的抑制RANKL與RANK結(jié)合，從而抑制骨吸收的發(fā)生。VEGF可與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF受體發(fā)生特異性結(jié)合，可以通過增加細(xì)胞外基質(zhì)而進(jìn)一步促進(jìn)血管形成[16]。并且其也可通過與骨折斷端的成骨細(xì)胞及周圍軟組織細(xì)胞上受體結(jié)合，改善骨折局部血運及缺氧狀態(tài)，加速骨折斷端局部壞死組織的移除，為骨折愈合提供營養(yǎng)物質(zhì)及骨修復(fù)細(xì)胞[17]。BMP-2能誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞，也可促進(jìn)骨床再生，增加軟骨和骨的合成，從而促進(jìn)骨折愈合[18]。本研究顯示早期組與晚期組的術(shù)后第1周、第2周的血清RANKL含量低于模型組(均P<0.05)，血清OPG含量高于模型組(均P<0.05)，早期組與晚期組對比差異也都有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；早期組與晚期組的術(shù)后第1周、第2周的血漿VEGF與BMP-2含量高于模型組(均P<0.05)，早期組高于晚期組(P<0.05)。從機(jī)制上分析，環(huán)抱器具有生物相容性好、低導(dǎo)磁、應(yīng)力遮擋率低等特點，其所產(chǎn)生的握持力可維持骨折斷端穩(wěn)定。在骨折術(shù)后早期進(jìn)行應(yīng)用能通過分泌細(xì)胞因子能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的分化和血管形成，從而調(diào)節(jié)VEGF、BMP-2、RANKL、OPG的表達(dá)，促使成骨細(xì)胞形成新骨[19]。

人體的脊柱、胸骨、肋骨、肋軟骨構(gòu)成了骨性胸廓的框架，在正常的呼吸循環(huán)中提供著胸廓運動的靈活性。肋骨骨折可導(dǎo)致機(jī)體血胸和氣胸等，如不采取積極的治療措施，會引發(fā)失血性休克甚或死亡等[20]。T淋巴細(xì)胞在骨折愈合的炎癥階段與修復(fù)塑形階段都發(fā)揮重要作用，其中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞都可直接或間接作用于骨髓干細(xì)胞以及成骨細(xì)胞，調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)，從而影響著骨折愈合的過程[21-23]。本研究顯示早期組與晚期組的術(shù)后第1周、第2周的CD4+T淋巴細(xì)胞比例高于模型組(P<0.05)，早期組高于對照組(P<0.05)，三組不同時間點的CD8+T淋巴細(xì)胞比例對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，表明早期進(jìn)行環(huán)抱器手術(shù)治療能改善機(jī)體免疫反應(yīng)，并使其處于平衡穩(wěn)定狀態(tài)，從而促進(jìn)骨折預(yù)后。本研究也存在一定的不足，沒有設(shè)置非手術(shù)治療組，觀察的時間點也比較少，將在后續(xù)研究中進(jìn)行探討。

總之，早期環(huán)抱器手術(shù)在肋骨骨折大鼠的應(yīng)用能改善機(jī)體免疫反應(yīng)，促進(jìn)VEGF、BMP-2、OPG的釋放，抑制RANKL的表達(dá)，從而促進(jìn)骨折愈合。