響應(yīng)面法優(yōu)化低酒精度桑果酒發(fā)酵的工藝參數(shù)

盧軍，劉開莉，陸春霞，肖瀟，周曉玲，梁貴秋，唐永飛，彭業(yè)成，韋炳佩

（廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站，南寧市 530007）

桑果是藥食同源的食物［1］，含有豐富的營養(yǎng)及活性物質(zhì)［2］。梁貴秋等［3］研究表明，桑果含有豐富的糖類、有機酸、膠質(zhì)、天然色素、維生素C、B1、B2等多種維生素、人體必需的氨基酸及鐵、鈣、鋅、硒、錳等多種微量元素，具有補血、益腎、明目、烏發(fā)、抗衰老、降血壓、預(yù)防慢性肝炎、治療失眠和神經(jīng)衰弱等多種醫(yī)療保健功能［3］。但是桑果含水率較高，約85%［4］，不耐貯存，容易腐爛，是季節(jié)性較強的水果，在廣西地區(qū)每年3—4月集中上市，貨架期較短。為了克服鮮桑果難以保存的不足，科研人員把桑果深加工后制成桑果酒［5］、桑果脯［6］、桑果醋［7］、桑果飲料［8］等，而桑果酒因含有大量的營養(yǎng)及活性物質(zhì)［9］，深受人們的青睞。低酒精度桑果發(fā)酵酒通常指酒精度較低，即酒精度≤3% vol 的桑果發(fā)酵酒。低酒精度桑果發(fā)酵酒是順應(yīng)市場需要而研制的桑果深加工新產(chǎn)品，因其酒精含量低、口感好而深受人們的歡迎，市場前景廣闊。本研究重點在于確定低酒精度桑果發(fā)酵酒的發(fā)酵工藝參數(shù)，為低酒精度桑果發(fā)酵酒的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 菌種來源 菌種為果酒酵母，生產(chǎn)廠家為安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 主要試驗試劑 低聚果糖（FOS 含量55%）為南寧縱聯(lián)科技有限公司生產(chǎn)；Na2HPO4為分析純，100%乙腈為色譜純，均由廣東汕頭市西隴化工廠生產(chǎn)；無水葡萄糖為分析純，購于天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站；超純水為自制。

1.1.3 試驗儀器 AL-2004 電子分析天平，由梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司生產(chǎn)；722 分光光度計，由上海第三分析儀器廠生產(chǎn)；R500L發(fā)酵罐，由江蘇天宇公司生產(chǎn)；PHS-25 精密數(shù)顯酸度計，由上海電子儀器廠生產(chǎn)；HH-4 電子恒溫水浴鍋，由常州澳華儀器有限公司生產(chǎn)；ANKE-TGL-16G臺式離心機，由上海安亭科學(xué)儀器廠制造；LC-10A 高效液相色譜儀，由日本島津公司生產(chǎn)；DZF-6050培養(yǎng)箱，由常州恒隆儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 培養(yǎng)基制備和培養(yǎng)方法

1.2.1 斜面保存培養(yǎng)基 斜面保存培養(yǎng)基配方為2.50%葡萄糖、1.50%蛋白胨、1.00%酵母浸出粉、0.02%NaH2PO4、2.00%瓊脂，pH 為6.8～7.2。將配好的培養(yǎng)基于121 ℃、0.1 Mpa條件下滅菌30 min，接種后置于28 ℃條件下培養(yǎng)30 h。

1.2.2 分離培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基配方為3.00%低聚果糖、1.50%蛋白胨、1.00%酵母浸出粉、0.20%硝酸鈉、0.02%NaH2PO4、2.00%瓊脂。將配好的培養(yǎng)基于121 ℃、0.1 Mpa條件下滅菌30 min，接種后在真空負壓培養(yǎng)箱中于30 ℃條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.3 一級酵母發(fā)酵種培養(yǎng)基 一級酵母發(fā)酵種培養(yǎng)基配方為3.50%低聚果糖、1.00%玉米漿粉、2.50%豆餅粉、0.15% MgSO4·7H2O、0.05%KH2PO3、pH為6.8～7.0，將配好的培養(yǎng)基于121 ℃、0.1 Mpa條件下滅菌60 min。接種后置于溫度30 ℃條件下培養(yǎng)20～28 h。

1.2.4 100 L 二級酵母發(fā)酵種培養(yǎng)基 二級酵母發(fā)酵種培養(yǎng)基配方為3.50%低聚果糖、1.00%玉米漿粉、2.50%豆餅粉、0.05%NaH2PO3、pH 為6.5～7.5。培養(yǎng)基配好后于121 ℃、0.1 Mpa條件下，滅菌60 min。接種后于溫度為30 ℃的條件下發(fā)酵20 h。

1.2.5 500 L 三級酵母發(fā)酵種培養(yǎng)基 三級酵母發(fā)酵種培養(yǎng)基配方為5.00%低聚果糖、1.00%玉米漿粉、1.50%豆餅粉，培養(yǎng)基配好后于121 ℃、0.1 Mpa條件下滅菌60 min。接種后于pH 6.8～7.2、溫度為30～28 ℃條件下發(fā)酵30～36 h。

1.2.6 酵母發(fā)酵和分離 用離心半徑為40 cm，轉(zhuǎn)速為2 950 r/min的沉降離心機離心30 min，分離得到黏稠酵母發(fā)酵種，置于1～3 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酒精度及殘?zhí)呛繙y定

參照國標GB/T 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法［10］。

1.4 低酒精度桑果發(fā)酵酒的加工工藝流程

桑果汁→接種酵母發(fā)酵→后發(fā)酵→澄清→調(diào)整→陳釀→過濾→滅菌→灌裝→包裝。

1.5 單因素試驗設(shè)計方法

1.5.1 酵母接種量對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?設(shè)置酵母接種量分別為3.0%、3.5%、4.0%，4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%，發(fā)酵溫度為25 ℃，pH=5.5，桑果汁糖度為10%，發(fā)酵時間為72 h進行試驗。

1.5.2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?設(shè)發(fā)酵溫度分別為18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃，pH=5.5，桑果汁糖度為10%，發(fā)酵時間為72 h，酵母接種量為5.0%進行試驗。

1.5.3 pH 對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?設(shè)發(fā)酵pH 分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，溫度為25 ℃，桑果汁糖度為10%，發(fā)酵時間為72 h，酵母接種量為5%進行試驗。

1.5.4 桑果汁糖度對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?用純凈水和低聚果糖調(diào)配桑果汁糖度分別為6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%，發(fā)酵溫度為25 ℃，pH=5.5，酵母接種量為5.0%，發(fā)酵時間為72 h進行試驗。

1.5.5 發(fā)酵時間對酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?設(shè)發(fā)酵時間為48 h、52 h、58 h、64 h、70 h、76 h、84 h、90 h、96 h、溫度為25 ℃，pH=5.5，桑果汁糖度為10%，酵母接種量為5.0%進行試驗。

1.6 響應(yīng)面試驗方法

利用Design-Expert 7.0 軟件中Box-Behnken 設(shè)計與分析，根據(jù)單因素試驗結(jié)果分別以酵母接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、pH（C）、桑果汁糖度（D）、發(fā)酵時間（E）為自變量，以酒精度（R1）和殘?zhí)呛浚≧2）為響應(yīng)值，利用Box-Behnken 模型設(shè)計試驗組作響應(yīng)面分析，試驗設(shè)計如表1所示。

表1 試驗因素及水平值

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 酵母接種量對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?在酵母接種量、發(fā)酵溫度、時間等其它因素相同的情況進行單因素試驗，結(jié)果見圖1。由圖1 可以看出，發(fā)酵酒精度隨酵母接種量增加而增加，但增加比較緩慢，酵母接種量為3.0%時發(fā)酵酒精度為1.20%vol（以下不特別標明均為體積比），酵母接種量為5.5%時，發(fā)酵酒精度為1.52% vol，之后隨酵母接種量增加，發(fā)酵酒精度增速有加快趨勢，酵母接種量為6.0%時發(fā)酵酒精度為1.78%vol，酵母接種量為7.5%時發(fā)酵酒精度為2.43%。酵母接種量為3.0%時殘?zhí)呛繛?.00%，隨酵母接種量增加，殘?zhí)呛縿t隨之減少，酵母接種量為7.5%時，殘?zhí)呛績H為0.50%，接近糖分完全被消耗。從圖1可以看出，曲線的相交點約在酵母接種量為4.5%處，此時發(fā)酵酒精度為1.39%vol，殘?zhí)呛繛?.40%。對比低酒精度桑果發(fā)酵酒的質(zhì)量標準，發(fā)酵酒精度是合適的，但殘?zhí)呛窟^高。從發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛恐笜司C合考慮，酵母接種量應(yīng)選擇在4.0%～6.0%的范圍之內(nèi)。

圖1 酵母接種量對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?/p>

2.1.2 溫度對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?溫度對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊懸妶D2。由圖2可以看出，發(fā)酵酒精度隨溫度升高也平穩(wěn)升高，當溫度為18～26 ℃時隨著發(fā)酵溫度升高酒精度升高平穩(wěn)，溫度為18 ℃時酒精度為1.20% vol，溫度為26 ℃時酒精度為1.46%vol，溫度升高了8 ℃，酒精度升高了0.26% vol，即溫度每升高1 ℃，酒精度平均升高0.03%vol；溫度為26 ℃時發(fā)酵酒精度為1.46%vol，當溫度為36 ℃時酒精度為2.17% vol，溫度升高了10 ℃，而酒精度升高了0.71%vol，即溫度每升高1 ℃酒精度平均升高0.07%vol?？梢姲l(fā)酵溫度低不利于酵母發(fā)酵產(chǎn)酒。溫度為18 ℃時殘?zhí)呛繛?.80%，隨溫度升高，殘?zhí)呛繙p少，當溫度升高至36 ℃時，殘?zhí)呛繛?.70%。發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛績汕€交匯點為酒精度1.28%，殘?zhí)呛繛?.10%。交匯點殘?zhí)呛咳赃^高，不合適選為發(fā)酵工藝參數(shù)，而從圖2可以得出合適的發(fā)酵溫度為24～28 ℃。

圖2 溫度變化對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛坑绊?/p>

2.1.3 pH對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?pH變化對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊懼饕前l(fā)酵體系酸堿性對酵母活性作用的影響，具體結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，pH=4.0時，發(fā)酵殘?zhí)呛繛?.70%，當pH 升至6.0 時，發(fā)酵殘?zhí)呛拷抵?.00%左右，之后隨pH 繼續(xù)上升，殘?zhí)呛坑珠_始上升，曲線呈“U”型，pH=7.0時殘?zhí)呛可?.90%；pH=4.0時發(fā)酵酒精度為1.31%vol，隨著pH 升高，發(fā)酵酒精度緩慢升高直至pH=5.5，然后從pH=5.5至pH=6.5時有一個明顯上坡度，從pH=6.5 至pH=7.5 時又有一個下坡度。從殘?zhí)呛壳€和酒精度曲線可以分析出pH=4.0～5.5 和pH=6.5～7.5 是抑制酵母活性的pH 值范圍，pH=5.5～6.5 是適合酵母生長的pH 值范圍。結(jié)合殘?zhí)呛亢途凭葍身椫笜司C合考慮可以得出：pH=6.5 時殘?zhí)呛畹停l(fā)酵酒精度最高，故發(fā)酵pH 范圍選擇應(yīng)為pH=5.0～6.0。

圖3 pH變化對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?/p>

2.1.4 桑果汁糖度對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?發(fā)酵過程中桑果汁中的糖是酵母利用的底物，發(fā)酵時桑果汁中含糖量高會得到更高的酒精度，但同時殘?zhí)呛恳矔黾?，選擇適合的桑果汁糖度是獲得低酒精度桑果發(fā)酵酒的重要因素之一，桑果汁糖度對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊懢唧w見圖4。從圖4中可以看出，殘?zhí)呛亢途凭榷茧S糖度增加而增加，但開始增加較為緩慢，糖度為6°Bx時殘?zhí)呛亢途凭确謩e為1.10%和1.49%，糖度增加至10°Bx時殘?zhí)呛亢途凭确謩e為2.17%和1.97%，曲線坡度平緩，當糖度大于11°Bx時，曲線坡度增加較快，糖度為14 °Bx 時，殘?zhí)呛亢途凭确謩e為4.30%和4.80%。糖度增加即發(fā)酵底物濃度增加，結(jié)果是發(fā)酵酒精度增加；而殘?zhí)呛吭黾訁s是因為糖度增加了但發(fā)酵不完全造成的。通常桑果汁的糖度為8°Bx～10°Bx，發(fā)酵糖度應(yīng)該選擇自然糖度8°Bx～10°Bx。

圖4 桑果汁糖度對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?/p>

2.1.5 發(fā)酵時間對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?發(fā)酵時間對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊懸妶D5。由圖5 可知，發(fā)酵48 h 時殘?zhí)呛亢途凭确謩e為29.00%和0.54%，此時發(fā)酵還沒有完全，隨發(fā)酵時間增加，殘?zhí)呛靠焖傧陆?，酒精度緩慢升高。當發(fā)酵時間為72 h 時，殘?zhí)呛繛?.60%，發(fā)酵時間為84 h時，殘?zhí)呛繛?.10%，殘?zhí)呛肯陆邓俣让黠@減慢。發(fā)酵酒精度隨發(fā)酵時間增加，一直平穩(wěn)增加，增加的幅度不大。發(fā)酵時間對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊懼饕请S時間增加，酵母的生長受到影響。酵母生長期、對數(shù)期、衰老期、自溶期等［11］隨時間增長依次出現(xiàn)酵母生理前期生長旺盛，消耗底物較多，殘?zhí)呛肯陆递^快，后期生理期生命衰老，消耗底物較弱，殘?zhí)呛肯陆稻徛＞C合殘?zhí)呛亢途凭葍身椫笜?，發(fā)酵時間應(yīng)選擇在72～84 h。

圖5 發(fā)酵時間對發(fā)酵酒精度和殘?zhí)呛康挠绊?/p>

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 利用Design-Expert.7.0中軟件Box-Behnken設(shè)計與分析，利用Box-Behnken模型設(shè)計試驗組作響應(yīng)面分析，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 Box--Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

續(xù)表2

2.2.2 酒精度的方差分析和回歸模型 酒精度（R1）方差分析見表3。表3是采用響應(yīng)面逐步回歸模型修正法進行方差分析，不顯著項已經(jīng)修正刪除。模型P值＜0.01，為極顯著，說明各因素變量與R1之間的線性關(guān)系顯著。失擬合項不顯著（P=0.118 8＞0.05），說明本試驗所得二次回歸方程能很好地對R1進行預(yù)測。試驗值與回歸方程預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)R12為0.980 1，說明該模型能解釋98.01%響應(yīng)值的變化，擬合情況很好。校正擬合度AdjR12為0.976 5和預(yù)測擬合度PredR12為0.967 5，兩者數(shù)字相近，且值接近于1，說明該模型具有較好的回歸性。離散系數(shù)表示試驗的精確度，其值越小，試驗結(jié)果的可靠性越高。本試驗離散系數(shù)為2.93，在可接受范圍內(nèi)，說明試驗結(jié)果可靠性很高。從回歸方程系數(shù)顯著性可知，一次項A、B和二次B2極顯著，一次項C、E項，互交項AB、AC表現(xiàn)顯著。由F值大小可得出各因數(shù)影響大小，依次為發(fā)酵溫度（B）＞酵母接種量（A）＞發(fā)酵時間（E）＞pH（C）。經(jīng)逐步回歸擬合后得到二次多項式編碼回歸方程：

表3 R1響應(yīng)逐步回歸（stepwise）模型方差分析

酒精度R1/%vol=1.45+0.13×A+0.40×B+0.03×C+0.03×E+0.05×A×B+0.06×A×C+0.29×B2

2.2.3 酒精度（R1）的響應(yīng)面分析 圖6～圖7 是AB、AC互交項為顯著項所得到的二次回歸方程的R1響應(yīng)面的3D 圖。圖底部等高線及曲面形狀反映交互作用大小，當為橢圓形時，表示交互作用顯著，而圓形則表示交互作用不顯著。

圖6 AB互交響應(yīng)值3D圖

圖7 AC 互交項響應(yīng)值3D圖

2.2.4 殘?zhí)呛浚≧2）的方差分析和回歸模型R2方差分析見表4。表4 中R2采用響應(yīng)面逐步模型修正法進行方差分析。模型P值＜0.01為極顯著，說明各因素變量與轉(zhuǎn)化率之間的線性關(guān)系顯著。失擬合項P=0.694 0＞0.05，不顯著，說明本試驗所得二次回歸方程能很好地對響應(yīng)值進行預(yù)測。試驗值與回歸方程預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)R22為0.932 8，說明該模型能解釋93.28%響應(yīng)值的變化，擬合情況很好。校正擬合度AdjR22為0.908 4和預(yù)測擬合度PredR22為0.842 8，兩者數(shù)字相近，且值接近1，說明該模型具有較好的回歸性。離散系數(shù)表示試驗的精確度，其值越小，試驗結(jié)果的可靠性越高。本試驗離散系數(shù)為3.63，在可接受范圍內(nèi)，說明試驗結(jié)果可靠性很高。從回歸方程系數(shù)顯著性可知，一次項A、B、D及二次項B2為極顯著，互交項AB、BD、DE表現(xiàn)為顯著。由F值大小可得出各因素影響大小，依次為發(fā)酵溫度（B）＞酵母接種量（A）＞桑果汁糖度（D）＞發(fā)酵時間（E）＞pH（C）。經(jīng)回歸擬合后得到二次多項式編碼回歸方程：

表4 R2響應(yīng)面逐步回歸（stepwise）方差分析表

殘?zhí)呛縍2/%=2.78－0.21×A－0.24×B+0.14×D－0.03×E－0.15×A×B+0.14×B×D－0.16×D×E－0.16×B2

2.2.5 殘?zhí)呛浚≧2）的響應(yīng)面分析 圖8～圖10是AB、BD、DE互交項為顯著項所得到的二次回歸方程的R22響應(yīng)值3D 圖。圖底部等高線及曲面形狀反映交互作用大小，當為橢圓形時，表示交互作用顯著，而圓形則表示交互作用不顯著。

圖8 AB互交項響應(yīng)值3D圖

圖9 BD互交項響應(yīng)值3D圖

圖10 DE互交項響應(yīng)值3D圖

2.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化最佳控制參數(shù) 經(jīng)過軟件分析，設(shè)置軟件響應(yīng)值R1和R2為最小化，預(yù)測得到最佳控制參數(shù)：酵母接種量為6.0%，發(fā)酵溫度為24.97 ℃，pH為5.0，桑果汁糖度為9.56%，發(fā)酵時間為72 h。響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果見圖11三維效果圖。

圖11 最佳條件三維效果和等高線圖

圖11是在pH（C）=5.0，桑果汁糖度（D）為9.56%，發(fā)酵時間（E）為72 h固定的情況下，以酵母接種量和發(fā)酵溫度為自變更量的3D 效果圖。由圖11 可看出等高線互交作用顯著，響應(yīng)曲面的傾斜度較高，顏色也由淺藍色向深綠色轉(zhuǎn)變，說明交互作用顯著，即模型可信度高。

2.3 模型驗證

根據(jù)優(yōu)化得到操作參數(shù)：酵母接種量為6.0%，發(fā)酵溫度為24.9 ℃，pH=5.0，桑果汁糖度為9.56%，發(fā)酵時間為72 h。按實際操作修正為酵母接種量（A）為6.0%，發(fā)酵溫度（B）為24.9 ℃，pH（C）=5.0，桑果汁糖度（D）為9.60%，發(fā)酵時間（E）為72 h。經(jīng)過5 次重復(fù)試驗，得到酒精度R1平均值為1.32%vol，殘?zhí)呛縍2平均值2.29%，與軟件預(yù)測數(shù)值基本一致。

3 小結(jié)

以桑果汁為原料發(fā)酵低酒精度桑果酒，桑果汁糖度、酵母量接種量、發(fā)酵溫度、pH值、發(fā)酵時間都對發(fā)酵后酒精度、殘?zhí)呛坑幸欢ǖ挠绊?，其中影響發(fā)酵后酒精度的因素順序為：發(fā)酵溫度＞酵母接種量＞發(fā)酵時間＞pH＞桑果汁糖度；影響發(fā)酵殘?zhí)呛康囊蛩仨樞驗椋喊l(fā)酵溫度＞酵母接種量＞桑果汁糖度＞發(fā)酵時間＞pH。利用Design-Expert.7.0中軟件Box-Behnken進行設(shè)計，利用Box-Behnken模型作響應(yīng)面分析，并經(jīng)過軟件優(yōu)化最終得到低酒精度桑果發(fā)酵酒發(fā)酵工藝參數(shù)：酵母接種量為6.0%，發(fā)酵溫度為24.9 ℃，pH=5.0，桑果汁糖度為9.60%，發(fā)酵時間為72 h。

4 討論

低酒精度桑果發(fā)酵酒與一般桑果發(fā)酵酒加工方法的不同之處在于發(fā)酵所用的酵母為混合酵母，該混合酵母由兩種酵母構(gòu)成，其中一種有利于桑果汁中的糖轉(zhuǎn)化為酒精，另外一種有利于桑果汁中乙酸的降解，因此利用本研究工藝加工的桑果酒酒精度不高，乙酸含量低，在口感上、適合飲用的人群方面都優(yōu)于一般的桑果酒，市場前景更為廣闊。

低酒精桑果發(fā)酵酒所用的酵母來源于市場銷售，本研究缺乏對酒精發(fā)酵產(chǎn)酒酵母和降酸酵母的生理特性和作用機理的深入研究，這有待進一步加強。

本研究的桑果發(fā)酵酒產(chǎn)品酒精度較低（＜10%vol），長期常溫保存會影響其品質(zhì)和口感，關(guān)于低酒精度桑果酒保質(zhì)期的問題有待于進一步研究。由于市售桑果發(fā)酵酒的酒精度普遍高于10%vol，通常為12%vol～14%vol，因此對保存期無需特別說明，而利用本研究工藝發(fā)酵的低酒精度桑果發(fā)酵酒的酒精度較低，因此在實際生產(chǎn)中需要注意保質(zhì)期問題。