外源鈣對鹽脅迫下羅漢果幼苗生理效應(yīng)的影響

趙 英， 張佳佳， 吳 敏， 鄧 平， 朱宇林*， 黃司翊

（1.玉林師范學(xué)院 生物與制藥學(xué)院，廣西 玉林537000； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌712100）

羅漢果（Siraitia grosvenorii）是葫蘆科多年生藤本植物的果實，原產(chǎn)我國廣西、廣東、江西等省的熱帶、亞熱帶山區(qū)，是衛(wèi)生部首批公布的藥食兩用的名貴中藥材，富含羅漢果甜苷、多種氨基酸和維生素等［1］.常飲羅漢果茶，可預(yù)防多種疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，羅漢果對支氣管炎、高血壓等疾病有顯著療效，還能起到防治冠心病、血管硬化、肥胖癥的作用.目前，廣西擁有大面積的羅漢果種植基地，羅漢果也是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)收入的主要來源.

土壤鹽堿化是影響全球農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)、發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的重大問題，也是影響我國廣西地區(qū)農(nóng)林生產(chǎn)的主要因素之一，同時灌溉農(nóng)業(yè)的發(fā)展和化肥使用不當(dāng)?shù)仍蛟斐傻拇紊}漬土壤面積擴(kuò)大，也嚴(yán)重限制了廣西地區(qū)羅漢果種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.鹽脅迫會抑制植物生長，使農(nóng)作物產(chǎn)量受到不同程度的影響.因此，提高植物的抗鹽性，減少鹽脅迫對于農(nóng)作物的影響是人們普遍關(guān)注的話題.鈣是植物所必需的營養(yǎng)元素，對維持細(xì)胞膜透性、離子運(yùn)輸、信號傳導(dǎo)、調(diào)控酶活性等有重要作用，研究［2-5］發(fā)現(xiàn)Ca2＋參與多種逆境脅迫過程，如鹽脅迫、高溫脅迫、低溫脅迫、氧脅迫等，可提高植物對逆境的適應(yīng)能力.當(dāng)植物受到外界脅迫時，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高，可與鈣調(diào)蛋白質(zhì)結(jié)合成激活態(tài)復(fù)合體，激活基因表達(dá)，啟動一系列反應(yīng)使植物適應(yīng)脅迫環(huán)境.華智銳等［6］研究發(fā)現(xiàn)施加適量濃度的外源鈣能顯著抑制鹽脅迫下黃芩幼苗MDA的積累；周紅菊［7］發(fā)現(xiàn)鹽脅迫能明顯降解葉綠素含量，外源鈣能有效緩解鹽脅迫對玉米幼苗葉綠素含量的影響；嚴(yán)蓓等［8］指出外源噴施Ca2＋可提高黃瓜幼苗的鹽脅迫耐性；楊莎等［9］在研究外源鈣對鹽脅迫下花生幼苗的影響時，發(fā)現(xiàn)施加外源鈣可以誘導(dǎo)花生幼苗抗氧化酶系統(tǒng)（CAT、POD和SOD）酶活性升高，祛除因鹽脅迫造成積累的活性氧，降低活性氧對花生幼苗的破壞程度.然而，鈣對植物鹽脅迫的緩解效果因鈣鹽種類、濃度、不同植物種類等而不同，目前外源鈣能否緩解鹽脅迫對羅漢果幼苗的傷害及其適宜濃度，還未見相關(guān)報道.因此，本文擬研究不同濃度的外源鈣對鹽脅迫下羅漢果幼苗生理特性的影響，以期為羅漢果幼苗的鹽漬栽培及品質(zhì)提高提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料本實驗于2019年4月15日上午9：00選用長勢一致，株高為30 cm左右的一年生羅漢果幼苗，栽培在內(nèi)徑為20 cm，高為15 cm的普通花盆內(nèi)，置于玉林師范學(xué)院農(nóng)學(xué)院玻璃溫室大棚，棚內(nèi)晝夜溫度分別為28和20℃，白天光強(qiáng)為1 200 μmol／（m2·s），相對濕度保持在60%±2.5%.培養(yǎng)土選用V（園土）∶V（基質(zhì)）∶V（有機(jī)肥）＝1∶1∶1比例混合混勻，盆內(nèi)土高12 cm，每個盆種植羅漢果幼苗1株，種植后土面上散上一層木屑起保水作用，在每株幼苗旁插上長120 cm的竹條，供幼苗攀爬.緩苗3周后開始鹽脅迫試驗.為保證幼苗健康生長，緩苗期土壤含水量為（25.4±1.23）%.

1.2 實驗設(shè)計前期實驗研究表明，羅漢果耐鹽性較弱，120 mmol／L的NaCl濃度會對羅漢果幼苗造成顯著影響，大于120 mmol／L的NaCl濃度甚至?xí)斐捎酌缢劳?，本試驗選擇臨界NaCl濃度120 mmol／L進(jìn)行.試驗于2019年5月11日在廣西玉林師范學(xué)院玻璃溫室大棚中進(jìn)行，本試驗采用完全隨機(jī)試驗，CaCl2濃度梯度分別為0、2、6、10、14和18 mmol／L（T1、T2、T3、T4、T5、T6），其中T1～T6為鹽脅迫（NaCl）組，且鹽脅迫濃度為120 mmol／L，以自來水處理為對照（CK），共計設(shè)置7個處理.脅迫處理14 d后，選擇長勢一致的幼苗，取植株中部生長一致的葉片，每個處理隨機(jī)選取3株進(jìn)行重復(fù)測定.具體試驗處理見表1.

表1 試驗處理設(shè)計Tab.1 Test processing design

1.3 實驗方法參照葉寶興［10］的測定方法，丙二醛（MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法.參照胡炳義等［11］的測定方法，可溶性蛋白含量的測定采用紫外吸收法測定.參照張志良［12］的方法，葉綠素（Chl）含量的測定采用丙酮提取法；脯氨酸含量采用磺基水楊酸法測定；過氧化氫酶（CAT）活性的測定，采用紫外吸收法；過氧化物酶（POD）活性的測定，采用愈創(chuàng)木酚法；超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定，采用用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用Excel 2007進(jìn)行圖表制作，運(yùn)用統(tǒng)計分析軟件SPSS 17.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗，以P＜0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn).采用隸屬函數(shù)值評價施加外源鈣對羅漢果幼苗耐鹽性的影響，若所測指標(biāo)與羅漢果幼苗耐鹽性呈正向關(guān)系，則隸屬函數(shù)值計算公式為

若某一指標(biāo)與鹽脅迫耐性呈反向關(guān)系，可通過反隸屬函數(shù)計算其隸屬函數(shù)值

其中，U為某一處理下的某一指標(biāo)的隸屬值，X為某一處理生理生化指標(biāo)參數(shù)的測定值，Xmin為該指標(biāo)測定值中的最小值，Xmax為測定值中的最大值［13］.

2 結(jié)果與分析

2.1 CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗MDA含量的影響MDA是植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，MDA含量不僅可以反映出組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，還能間接反映植物細(xì)胞受損傷的程度［14］，在一定鹽脅迫范圍內(nèi)可以作為鑒定植物耐鹽性的生理指標(biāo)［15］.由圖1可知，濃度為120 mmol／L的鹽脅迫下，羅漢果幼苗MDA含量顯著升高（P＜0.05），施入不同濃度的外源Ca2＋均能顯著降低羅漢果幼苗MDA的含量（P＜0.05），且隨著外源鈣濃度的提高，羅漢果幼苗MDA含量先降低后升高，當(dāng)Ca2＋濃度為6 mmol／L時，MDA含量最低，與T1相比羅漢果幼苗MDA含量下降了45.53%，但仍顯著高于CK（P＜0.05）；當(dāng)外源Ca2＋濃度大于6 mmol／L時，羅漢果幼苗丙二醛含量顯著增加，但仍小于T1中MDA的含量，說明不同濃度的外源鈣能夠緩解120 mmol／L濃度的鹽脅迫對羅漢果幼苗的傷害，但存在一定差異.

圖1 不同濃度CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗MDA含量的影響Fig.1 Effect of CaCl 2 concentration on malondialdehyde content of siraitia grosvenorii seedlings undersalt stress

2.2 CaCl2對鹽脅迫下羅漢果幼苗可溶性蛋白的影響由圖2可知，當(dāng)受到鹽脅迫時，羅漢果幼苗葉片可溶性蛋白含量顯著增加（P＜0.05）.

圖2 不同濃度CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of CaCl 2 concentration on soluble protein content of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

不同濃度的外源Ca2＋均可增加葉片可溶性蛋白含量，但增幅不同.隨著外源Ca2＋濃度的增加，可溶性蛋白呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢.

當(dāng)Ca2＋濃度在6 mmol／L時，可溶性蛋白含量達(dá)到最大值（P＜0.05），與T1相比增幅達(dá)76.68%；當(dāng)Ca2＋濃度大于6 mmol／L時，可溶性蛋白含量減小，但仍顯著高于T1可溶性蛋白含量（P＜0.05），這可能是由于羅漢果幼苗在受到鹽脅迫時，為適應(yīng)生長環(huán)境而在體內(nèi)合成了某種蛋白酶，以應(yīng)對逆境下的不良影響.一定濃度的外源Ca2＋可以有效提高對鹽脅迫下的羅漢果幼苗可溶性蛋白含量，降低滲透勢，增大膨壓，提高羅漢果幼苗抵御外界鹽脅迫的能力，但當(dāng)外源Ca2＋濃度大于10 mmol／L時，可溶性蛋白含量顯著降低（P＜0.05），這可能是由于植物組織細(xì)胞內(nèi)鈣離子累積量過高，打破了細(xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)劑物質(zhì)的平衡狀態(tài)，從而抑制可溶性蛋白增加，說明不同植物種類對外源鈣耐受力與生理反應(yīng)不相同.濃度為6～10 mmol／L的CaCl2能顯著增加濃度為120 mmol／L的鹽脅迫下羅漢果幼苗可溶性蛋白的含量.

華智銳等［16］研究外源Ca2＋對鹽脅迫下商洛丹參的影響，發(fā)現(xiàn)一定濃度的外源Ca2＋會使鹽脅迫下丹參幼苗可溶性蛋白含量增加，這與本文研究結(jié)果一致.

2.3 CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗脯氨酸含量的影響脯氨酸作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在維持植物體原生質(zhì)穩(wěn)定性上起著至關(guān)重要的作用.脯氨酸還可通過改善一些抗氧化酶活性、光合活性和植物生長，來增強(qiáng)植物的耐鹽性［17-18］.如圖3所示，羅漢果幼苗在120 mmol／L鹽脅迫下，脯氨酸含量顯著增加（P＜0.05）.

圖3 不同濃度CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of CaCl 2 concentration on proline content of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

施入外源Ca2＋后，羅漢果幼苗脯氨酸含量隨著Ca2＋濃度升高呈先升后降的趨勢，且均顯著高于CK和T1（P＜0.05）.外源Ca2＋濃度為6 mmol／L時，脯氨酸含量達(dá)到最大值，與T1相比增加了148.69%（P＜0.05）；外源Ca2＋濃度大于6 mmol／L時，羅漢果幼苗脯氨酸含量下降，與T1相比分別增加了124.92%、117.29%和112.67%.可見不同濃度的外源鈣能夠提高羅漢果幼苗脯氨酸的含量.

2.4 CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗葉綠素含量的影響葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，葉綠素含量是影響植物光合作用的重要因素，葉綠素含量的高低在一定程度上反映植物進(jìn)行光合作用的水平［19］.

由圖4可以看出，120 mmol／L鹽脅迫處理下，羅漢果幼苗Chl a、Chl b含量均顯著降低（P＜0.05）；隨著外源Ca2＋濃度的增加，Chl a、Chl b含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢；當(dāng)外源Ca2＋濃度為6 mmol／L，Chl a、Chl b含量達(dá)到最大值，與T1相比分別增加了73.71%和31.36%；當(dāng)外源Ca2＋濃度大于6 mmol／L時，Chl a、Chl b含量逐漸減少，T6處理下，羅漢果幼苗Chl a、Chl b含量最少.同時，120 mmol／L鹽脅迫處理后羅漢果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b均顯著低于CK（P＜0.05）.隨外源Ca2＋濃度增加羅漢果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b呈先升高后降低，經(jīng)方差分析T1～T4處理，其中T3處理后，羅漢果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b甚至超過對照CK，分別增加了6.42%和20.29%.T6處理下羅漢果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b均達(dá)到最低.

圖4 不同濃度CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗葉綠素含量的影響Fig.4 Effect of CaCl 2 concentration on chlorophyll content of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

2.5 CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗葉片CAT、SOD和POD活性的影響由圖5可知，與CK相比，120 mmol／L鹽脅迫處理下，羅漢果幼苗POD、CAT活性顯著增強(qiáng)，SOD活性顯著降低（P＜0.05）.外源施加不同濃度Ca2＋，均能提高3種保護(hù)酶活性.隨著外源Ca2＋濃度的增加，SOD、POD、CAT活性均先增強(qiáng)后減弱；不同濃度的外源Ca2＋均能顯著提高120 mmol／L鹽脅迫下羅漢果幼苗SOD和CAT活性；T2、T3處理下，羅漢果幼苗SOD、POD和CAT活性均隨著Ca2＋濃度升高而升高，當(dāng)Ca2＋濃度為6 mmol／L時，羅漢果幼苗體內(nèi)SOD、POD和CAT活性達(dá)到最大，與T1相比增加顯著（P＜0.05），分別增加83.53%、21.11%和78.81%；當(dāng)Ca2＋大于6 mmol／L時，羅漢果幼苗SOD、POD活性顯著降低（P＜0.05），CAT活性降低.T6處理下，羅漢果幼苗SOD、POD和CAT活性最低.

圖5 不同濃度CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effect of CaCl 2concentration on SOD，POD，CAT activity of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

2.6 不同濃度外源鈣對鹽脅迫下羅漢果幼苗各指標(biāo)的隸屬度分析隸屬函數(shù)值可分為4個等級，其等級代表植物適應(yīng)環(huán)境的不同程度：不抗型（隸屬值 ＜0.2）、弱抗型（0.2≤隸屬值≤0.4）、中抗型（0.4≤隸屬值≤0.6）、高抗型（0.6≤隸屬值≤1）［20］.將外源鈣對鹽脅迫下羅漢果幼苗測定的10個指標(biāo)生理指標(biāo)參數(shù)的隸屬函數(shù)計算加權(quán)平均值，綜合評價外源鈣對羅漢果耐鹽性的影響，如表2所示.在CK～T6處理下，不同濃度CaCl2處理羅漢果幼苗的耐鹽性綜合排名

表2 不同濃度CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗各指標(biāo)的隸屬度分析Tab.2 Analysis of the subordinate degree of different concentrations of CaCl 2 on the indexes of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

可見T1和T6處理屬于弱抗型，T2、T5屬于中抗型，CK、T3和T4屬于高抗型.因此，緩解羅漢果幼苗鹽脅迫最好的外源鈣濃度為6 mmol／L.

3 結(jié)論與討論

植物遭到鹽脅迫時，活性氧代謝平衡被破壞，活性氧積累，自由基增加，生理指標(biāo)發(fā)生不同程度的變化.文獻(xiàn)［21］研究表明，Ca2＋是植物生長所必須的大量元素，是偶聯(lián)胞外信號和胞內(nèi)生理反應(yīng)的第二信使，在調(diào)節(jié)植物細(xì)胞對逆境適應(yīng)性過程中發(fā)揮著重要作用.Ca2＋可增加質(zhì)膜的穩(wěn)定性和鈣信號系統(tǒng)的正常發(fā)生和傳遞，以維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡，降低質(zhì)膜透性，組織胞內(nèi)鉀離子的外滲和鈉離子的進(jìn)入.MDA作為膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，直接關(guān)系到植物細(xì)胞膜受損程度.本試驗中鹽脅迫處理下羅漢果幼苗葉片MDA含量升高，表明鹽脅迫加強(qiáng)了植物細(xì)胞膜脂過氧化程度；施入不同濃度的外源鈣后，MDA含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，說明一定濃度的外源Ca2＋達(dá)到6 mmol／L時能夠有效緩解鹽脅迫對羅漢果幼苗的傷害，利于植物器官壽命的延長［22］.但當(dāng)外源鈣濃度過高時，這種緩解作用就被抑制，這與鄭秀芳等［23］對馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）的研究相一致.

可溶性蛋白、脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，這些物質(zhì)含量的積累有利于植物耐鹽性提高［22］.鹽脅迫下，羅漢果幼苗通過提高自身滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)緩解鹽脅迫帶來的傷害，加入外源Ca2＋后受顯著增強(qiáng)了羅漢果幼苗可溶性蛋白及脯氨酸含量.當(dāng)外源Ca2＋濃度為6 mmol／L時，羅漢果幼苗可溶性蛋白和脯氨酸含量最高；說明適宜濃度的外源Ca2＋可以有效提高羅漢果幼苗可溶性蛋白及脯氨酸含量，羅漢果幼苗通過提高自身滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)抵御鹽脅迫帶來的傷害.

葉綠素含量在一定程度上反映植物同化物質(zhì)能力的強(qiáng)弱［24］.鹽脅迫對羅漢果幼苗葉綠素含量影響顯著，鹽脅迫下，羅漢果幼苗Chl a、Chl b、Chl a＋b含量和Chl a／b均顯著下降，這可能是由于鹽脅迫下葉綠體中的光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的光能捕獲和用于電子傳遞的量子產(chǎn)額，從而影響了植物的光合性能［25］.導(dǎo)致鹽脅迫下葉綠素含量會降低，施入不同濃度外源Ca2＋后，羅漢果幼苗Chl a、Chl b、Chl a＋b含量和Chl a／b先增加后降低.當(dāng)外源Ca2＋為6 mmol／L時，Chl a、Chl b、Chl a＋b含量和Chl a／b均達(dá)到最大值，這可能是因為一定濃度的外源Ca2＋能顯著增強(qiáng)植物葉片抗氧化酶活性，清除活性氧，大大緩解葉綠素含量的分解，增強(qiáng)植物葉片對鹽脅迫的適應(yīng)性，提高植物葉片利用光的能力，這與劉麗等［26］研究結(jié)果一致.

鹽脅迫下，SOD、POD、CAT作為植物抗氧化物保護(hù)酶，能夠清楚自身多余的活性氧及自由基［27］.本文中羅漢果幼苗在120 mmol／L鹽脅迫時，SOD活性減弱，POD、CAT活性增強(qiáng)，加入不同濃度的外源Ca2＋后，SOD和CAT活性均顯著增強(qiáng).POD除在T2處理后活性降低外，其余活性均顯著增加，說明外源Ca2＋能有效提高羅漢果幼苗抗氧化酶活性，這與劉藝平等［28］的研究結(jié)果一致.當(dāng)外源Ca2＋達(dá)到6 mmol／L時，SOD、POD、CAT活性均達(dá)到最高，說明濃度為6 mmol／L的外源Ca2＋能顯著提高鹽脅迫下羅漢果幼苗抗氧化酶活性.

經(jīng)隸屬函數(shù)綜合分析表明，不同濃度CaCl2處理羅漢果幼苗的耐鹽性綜合排名為

可見，T1、T6處理屬于弱抗型，T5、T2屬于中抗型，T4、CK和T3屬于高抗型.因此，外源鈣濃度為6～10 mmol／L能顯著緩解羅漢果幼苗鹽脅迫，濃度為6 mmol／L效果最佳.