健脾復方通過Exo-Wnt3a/5a調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移機制研究

靖 琳，閆國良，樓丹飛，汪海慧

（上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院急診科，上海 200071）

大腸癌為臨床上一種常見的惡性腫瘤，臨床主要采用手術切除的方式治療。外泌體（exosomes）在調(diào)節(jié)細胞功能，腫瘤轉(zhuǎn)移及發(fā)展中有重要意義。與正常細胞相比，大腸癌腫瘤細胞會釋放更多外泌體，從而在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中起到關鍵作用。外泌體來源的Wnt3a/5a，可對Wnt/β-catenin信號通路產(chǎn)生影響。當Wnt3a/5a信號刺激細胞時，Wnt蛋白會與細胞膜表面受體結(jié)合，從而加快癌細胞的轉(zhuǎn)錄，提高癌細胞的增殖［1］。本研究對裸鼠人腸癌轉(zhuǎn)移瘤模型進行研究，觀察健脾復方對β-catenin、MMP-7、C-MYC、CyclinD1等信號分子的調(diào)節(jié)，探索健脾復方對大腸癌細胞轉(zhuǎn)移的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

選用60只SPF級雄性健康BALB/c裸鼠，體質(zhì)量18～20g，4～6周齡，購于上海市中醫(yī)醫(yī)院實驗動物中心。HCT116/LoVo細胞株來自中科院上海細胞庫，Wnt3a/5a、β-catenin抗體、CyclinD1均來自abcam。

1.2 方法

1.2.1 分組

將小鼠隨機分為空白對照組（A組）、陽性對照組（B組）、健脾復方低劑量組（C組）、健脾復方中劑量組（D組）、健脾復方高劑量組（E組），每組12只。

1.2.2 模型建立

取對數(shù)生長期的HCT116/LoVo細胞株制為1×107/mL的細胞懸液，經(jīng)臺盼藍染色液測定細胞活性后，取200mL懸液對B、C、D、E組小鼠進行尾靜脈注射，待腫瘤生長到100～300mm3，進行后續(xù)實驗。

1.2.3 健脾復方干預

健脾復方［4］基礎方為黃芪30g，炒白術15g，半夏10g，藤梨根30g，淫羊藿15g，薏苡仁30g。使用顆粒中藥溶解物（江陰天江藥業(yè)有限公司）。成人使用健脾復方為1劑130g，相當于顆粒中藥13.08g，小鼠灌胃劑量以人臨床等效劑量的5～10倍計算，人與小鼠的藥物換算系數(shù)為12.33，以人的體質(zhì)量60kg計算，20g小鼠1天所需總生藥量T=（13.08g/60kg）×12.33×0.02kg×（10）=1.35g/mL。每日給裸鼠灌胃1次，每次0.4mL。連續(xù)給藥2周。

1.3 測定指標

治療結(jié)束后，立即處死裸鼠，迅速剝離瘤體進行檢測，記錄裸鼠腫瘤發(fā)生率。

1.3.1 Western Blot檢測

檢測相關Wnt信號通路蛋白，提取各組瘤體組織總蛋白，測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液混勻，在進行加熱至100℃，冷卻后加入PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉進行1h封閉，置于4℃一抗中過夜，于過氧化物酶標記的二抗中孵育1h，使用ECL顯色法進行顯色，采用Image J對圖像進行分析，重復分析3次后得到結(jié)果。

1.3.2 流式細胞儀檢測

使用無血清培養(yǎng)液進行24h培養(yǎng)，加入緩沖液進行重置，將瘤體細胞密度調(diào)節(jié)為1～5（106個/mL）。取0.1mL細胞懸液于流式細胞儀試管內(nèi)，按照標準試劑操作步驟進行檢測，重復分析3次后得出結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學分析

用SPSS22.0對標本數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以（%）表示、用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示、用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組裸鼠Wnt通路相關蛋白表達比較

A組有1只裸鼠、B組有3只裸鼠、C組有2只裸鼠、D組和E組有3只裸鼠分別死于惡病質(zhì)，各組中裸鼠瘤體β-catenin、MMP-7、C-MYC、CyclinD1表達的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。A組表達水平較低，B組表達水平高于A組，C、D、E組蛋白表達逐漸趨于正常，與B組相比，D、E組蛋白表達量低于B組（P＜0.05），如表1所示。

表1 各組裸鼠Wnt通路相關蛋白表達比較 （±s）

表1 各組裸鼠Wnt通路相關蛋白表達比較 （±s）

組別 例 β-catenin MMP-7 C-MYC CyclinD1 A 11 0.81±0.07 0.63±0.18 0.56±0.12 0.42±0.08 B 9 1.55±0.13 1.21±0.15 1.42±0.32 1.11±0.03 C 10 1.27±0.18 1.01±0.19 1.31±0.21 0.98±0.08 D 9 1.02±0.27 0.84±0.16 1.13±0.20 0.72±0.12 E 9 0.84±0.27 0.63±0.29 0.92±0.23 0.56±0.23

2.2 各組裸鼠藥物干預后瘤體質(zhì)量比較

B、C組裸鼠瘤體質(zhì)量高于其余3組，隨著健脾復方劑量上升，D、E組質(zhì)量均下降，如表2所示。

表2 各組裸鼠干預后瘤體質(zhì)量比較 （g，±s）

表2 各組裸鼠干預后瘤體質(zhì)量比較 （g，±s）

組別 成瘤數(shù) 瘤體質(zhì)量A 0 0 1.48±0.18 C 10 1.16±0.22 D 8 0.79±0.17 B 8 0.42±0.14 E 6

2.3 Wnt3a/5a對細胞增殖、侵襲及Wnt/β-catenin信號通路的影響

Western Blot結(jié)果表明，觀察組細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路的Wnt3a/5a蛋白表達及β-catenin蛋白表達量均低于對照組，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。對照組Wnt3a/5a蛋白相對表達量為（1.01±0.07），觀察組（0.52±0.11），（t=14.556，P=0.000）。熒光酶報告表明，Wnt3a/5a結(jié)合位點發(fā)生突變后，熒光酶活性降低，表明健脾復方可直接抑制癌細胞內(nèi)Wnt3a/5a表達。流式細胞儀結(jié)果顯示，觀察組細胞侵襲能力低于對照組細胞，轉(zhuǎn)入Wnt3a/5a可降低細胞侵襲能力，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。另轉(zhuǎn)入Wnt3a/5a后，Wnt/β-catenin信號通路下游蛋白表達水平明顯降低。見圖1、圖2。

圖1-Wnt3a、Wnt5a蛋白檢測電泳圖

圖2-Western Blot檢測Wnt/β-catenin信號通路的蛋白表達

3 討 論

大腸癌如今首選臨床治療方式為手術切除，但這一般對早期癌癥較為有效，對于癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，臨床上主要使用化療、放療等方法。中醫(yī)認為大腸癌是內(nèi)因與外因共同作用的結(jié)果，外在因素包括情志不遂、氣滯血瘀等，內(nèi)在因素包括腎氣不足、陰虛濕熱等。治療需調(diào)理陰陽、益氣補血，提高患者生活質(zhì)量［3］。

中醫(yī)本無大腸癌之稱，但古代對“癌”卻有一定認識，楊士瀛在《遺方論》［4］指出“癌者，毒根深藏，穿孔透里”，內(nèi)因主要為脾胃功能失調(diào)。李東垣《脾胃論》：“元氣充足表示脾胃無所傷?！薄坝辛鲶w必虛，有虛首健脾”，因此可用健脾解毒中藥治療。健脾復方中白術健脾燥濕，薏苡仁利水滲濕，薏苡仁、白術合用可增強脾功能，增化濕之效。黃芪補腎中元氣、健脾益氣，藤梨根清熱利濕、活血化瘀，淫羊藿補肺、補腎、益精血，半夏燥濕化痰，半夏配藤梨根、淫羊藿等可消腫止痛、化瘀散結(jié)［5-6］。諸藥合用，有活血化瘀、健脾和胃之效，標本兼治。腫瘤細胞中有基質(zhì)金屬蛋白酶等相關蛋白，可與腫瘤相互作用促進其轉(zhuǎn)移。Wnt/β-catenin信號是細胞分化、遷移、生長的重要調(diào)控因子之一，一旦被激活，就能通過Wnt調(diào)控進行b-catenin的穩(wěn)定積累，對細胞增殖、腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展有重要相關性。而異常激活的Wnt/β-catenin信號會促進細胞增殖，發(fā)生改變，促進腫瘤細胞生長，且Wnt3a/5a可促進β-catenin進入細胞核，促進下游蛋白表達，使癌細胞過度激活［7-8］。D、E組裸鼠腫瘤體積低于B、C組，表明健脾復方在癌細胞生長、分化、增殖方面，可顯著抑制其增殖、侵襲，促進其凋亡，從而控制大腸癌發(fā)展。原因可能是健脾復方中黃芪、黨參可刺激腎上腺皮質(zhì)激素分泌，從而誘導腫瘤細胞凋亡，提高機體抗腫瘤能力［9］。同時，裸鼠Wnt/β-catenin信號受到顯著抑制，Wnt3a/5a均少于對照組，表明健脾復方可抑制大腸癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而抑制癌細胞增殖［10］。除此之外，晚期患者體內(nèi)免疫功能會出現(xiàn)嚴重下降，而健脾復方內(nèi)的黨參、黃芪、茯苓等可有效調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能，激活T細胞、NK細胞等免疫細胞活性，清除體內(nèi)老化細胞、病原體，促進白細胞介素-1、白細胞介素-2等炎性因子產(chǎn)生，從而提高免疫能力［11］。放療對體內(nèi)正常細胞也會有一定影響，而健脾復方中黃芪、黨參可提高巨噬細胞的吞噬能力，增加化療效果的作用，減輕不良反應［12］。研究還得出β-catenin、MMP-7、C-MYC、CyclinD1在健脾復方高劑量組中表達水平最低，陽性對照組裸鼠表達高于健脾復方組，即β-catenin異常表達與MMP-7、C-MYC、CyclinD1在大腸癌腫瘤細胞中出現(xiàn)高表達有明顯正相關性（P＜0.05）表明健脾復方可下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路表達，對相關腫瘤因子進行調(diào)整，達到改善病癥的療效［13］。Wnt/β-catenin信號通路作為調(diào)控大腸癌細胞生長的重要通路之一，β-catenin蛋白對細胞活化十分重要。癌細胞侵襲是指腫瘤細胞向局部侵犯或遠處轉(zhuǎn)移，這是惡性腫瘤的重要特征之一，表明健脾復方可有效恢復機體內(nèi)平衡，避免癌細胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，從而為腫瘤轉(zhuǎn)移治療提供新思路。李玉山等［14］指出，Wnt/β-catenin信號通路具有維持正常胃腸道細胞及調(diào)控大腸癌癌細胞生長、增殖的作用。因此，Wnt/β-catenin信號通路可作為預防、治療大腸癌的作用措施，即對其進行調(diào)控來降解β-catenin蛋白。王雨艷等［15］檢測卵巢癌SKOV-3 細胞增殖、侵襲和凋亡的變化，結(jié)果顯示W(wǎng)nt3a可調(diào)控β-catenin的表達，抑制細胞周期蛋白合成，從而改善預后。李孝瓊等［16］對Wnt3a進行上調(diào)，發(fā)現(xiàn)β-catenin增加，表明Wnt3a/5a可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路對癌細胞進行調(diào)控。研究通過熒光酶基因?qū)嶒灱癢estern Blot檢測，證明健脾復方可通過Wnt3a/5a有效調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，從而對細胞增殖進行控制。

綜上所述，健脾復方可通過Wnt3a/5a對Wnt/β-catenin信號通路活化進行調(diào)控，從而控制癌細胞的生長及轉(zhuǎn)移。