西藏青稞種質(zhì)資源苗期耐低氮鑒定與篩選

扎 桑，旺 姆，徐齊君

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，西藏 拉薩 850032）

裸大麥在我國藏區(qū)被稱作青稞，作為藏族人民的主食在西藏廣泛種植，同時也是主要牲畜飼料、啤酒、保健品和醫(yī)藥的生產(chǎn)原料［1］，占西藏糧食總產(chǎn)的80%以上［2］。在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，土壤是植物吸收營養(yǎng)的主要介質(zhì)，土壤中的氮素含量是限制植物生長的主要因素之一［3］。氮是植物生長發(fā)育所必需的元素，是核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、葉綠素和部分植物激素的必要組成成分，是作物吸收的第一大必需營養(yǎng)元素，占植株干質(zhì)量的5%～2%，也是作物生長和產(chǎn)量的主要限制因子［4］。受自然條件和人為等方面因素限制，青稞生產(chǎn)始終處于極端落后的狀態(tài)，化肥施用缺乏科學(xué)性，致使青稞產(chǎn)量低、品質(zhì)差肥料利用率低，土壤肥力不斷下降，嚴(yán)重制約著當(dāng)?shù)厍囡a(chǎn)的發(fā)展［5］。劉國一等［6］認(rèn)為西藏青稞在施氮量低于281.55 kg/hm2時產(chǎn)量隨施氮量增加而增加。氮肥對青稞的生理作用是多方面的，一方面氮素與青稞體內(nèi)的有機(jī)酸合成氨基酸，再由氨基酸進(jìn)一步合成蛋白質(zhì)，從而形成各種新生組織。在青稞不同的生育時期以不同的方式追施氮肥對各經(jīng)濟(jì)性狀的影響是不盡相同的。據(jù)研究，青稞一生中吸氮的高峰期在出苗之拔節(jié)期，吸氮量占全生育期的75.6%［7］，孕穗之灌漿期是青稞生長發(fā)育的另一個關(guān)鍵時期。在日喀則地區(qū)生產(chǎn)上，主要以尿素作為追肥來補(bǔ)充春青稞生育期內(nèi)氮素的不足。當(dāng)?shù)剞r(nóng)民主要以隨灌水或雨水撒施為主要的追肥方式，而這種追肥方式化肥會隨水而走，容易造成追肥不均勻，并且一部分化肥要被水帶走浪費(fèi)掉。據(jù)研究，我國小麥、水稻和玉米對氮肥的利用效率在28%～41%之間［8］。

有研究亦表明：適量施用氮肥可以顯著提高青稞產(chǎn)量，但青稞對氮肥比較敏感，過量施用氮素會使青稞在苗期徒長，分蘗增加，無效分蘗增多；在青稞拔節(jié)期使用過量氮肥還會使青稞的第1～2節(jié)間快速生長，莖稈缺乏韌性，在灌漿后期易倒伏，影響青稞產(chǎn)量［9］。所以，對青稞的施肥應(yīng)適量，要根據(jù)種植品種的需肥量、土地的供肥量和土壤水分情況決定化肥用量［10］。

土壤貧瘠是一個世界性的問題，西藏地區(qū)普遍存在土壤貧瘠、施肥少等嚴(yán)重問題，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平低下。其中氮素已經(jīng)成為限制青稞產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素之一。

因此培育適應(yīng)西藏地區(qū)土壤貧瘠環(huán)境的青稞新品種研究工作任務(wù)緊迫。近年來氮肥施用量逐年增加，但肥料效益卻逐年降低，世界氮肥的平均利用率為40%～60%，而我國僅為30%～35%［11-12］?？茖W(xué)、合理、高效地利用氮肥資源，對提高小麥產(chǎn)量和氮素利用效率、改善小麥品質(zhì)、減少環(huán)境污染負(fù)荷具有重要意義［13-14］。已有研究表明，小麥耐低氮脅迫的能力和氮素的吸收及利用率存在顯著的基因型差異［15-16］，但相關(guān)研究所用試驗(yàn)材料絕大多數(shù)是國內(nèi)小麥品種，關(guān)于國內(nèi)和國外品種之間耐低氮脅迫和耐高氮傷害的差異研究較少。此外，耐氮脅迫的研究多以產(chǎn)量作為評價耐低氮的主要標(biāo)準(zhǔn)，費(fèi)工費(fèi)時。耐氮脅迫的苗期水培法鑒定具有耗時短、容量大、重復(fù)性強(qiáng)、易于活體鑒定和環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)成為篩選評價耐氮脅迫品種差異最常用的方法［17-19］。因此本試驗(yàn)以1029份青稞品種為研究對象，以Hoagland［20］營養(yǎng)液為介質(zhì)，對2葉期的青稞幼苗進(jìn)行缺氮和對照2組處理試驗(yàn)，對來自西藏各地的1029個青稞品種材料進(jìn)行青稞苗期氮脅迫處理，再對各材料做耐低氮性分級。通過對缺氮和對照組條件下青稞的株高變化量和地上生物量的鮮質(zhì)量及干質(zhì)量等指標(biāo)進(jìn)行測定和分析，以篩選出耐貧瘠和對缺氮脅迫敏感的青稞品種，從而為探明不同青稞品種在缺氮條件下的生理響應(yīng)特性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試的1029份青稞品種均來自西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所收集的青稞種質(zhì)資源。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)在西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室燈光室內(nèi)完成。試驗(yàn)期為2020年4-11月。本試驗(yàn)用水培法控制氮元素的含量，設(shè)缺氮和適氮（對照和CK）2個處理。按照Hoagland溶液配方［20］配制不同營養(yǎng)液。耐氮脅迫的苗期水培法鑒定具有耗時短、容量大、重復(fù)性強(qiáng)、易于活體鑒定和環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)成為篩選評價耐氮脅迫品種差異最常用的方法［21-22］。

種子處理與幼苗培養(yǎng)的方法：選擇飽滿的青稞種子，用0.5%高錳酸鉀處理種子15 min，然后用蒸餾水漂洗，將洗凈的種子放在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行催芽處理，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為27℃，濕度為60%～70%，黑暗條件下培養(yǎng)1～2 d。待催芽后，選擇發(fā)芽較為一致的種子播種到育苗盤（河沙）中，待大部分植株具有2～3片葉時（消耗自身胚乳的營養(yǎng)），轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)2周（營養(yǎng)液按照Hoagland配方配制），每3天換一次營養(yǎng)液（保持pH=6.0的穩(wěn)定性），并定時用氣泵充氧；然后進(jìn)行缺氮脅迫處理，每天拍照記錄，耐低氮脅迫處理14 d后開始青稞苗期耐低氮評級。青稞耐低氮分級標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級，強(qiáng)，死亡率5%以下；Ⅱ級，較強(qiáng)，死亡率5%～15%；Ⅲ級，中，死亡率15%～30%；Ⅳ級，較弱，30%～45%；Ⅴ級，弱，死亡率45%～60%以上。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

通過處理初步篩選的30份耐貧瘠和30份缺氮敏感的青稞材料進(jìn)行生長指標(biāo)和生理指標(biāo)的測定。

1.3.1 植株高度

用卷尺分別測量株高（主莖的垂直高度）。在數(shù)據(jù)處理的方差分析中，株高變化量=對照組株高生長量-缺氮組株高生長量。

1.3.2 地上生物量的測定（鮮質(zhì)量和干質(zhì)量）

處理后，將地上生物量分別取樣，先在120℃下殺青，然后在80℃下烘干至恒質(zhì)量［23］。在數(shù)據(jù)處理的方差分析中，地上生物量變化量=對照組地上生物量-缺氮組地上生物量。

1.3.3 生理指標(biāo)測定

分別隨機(jī)取各處理組青稞葉片，3次重復(fù)，測定丙二醛（MDA）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性等生理指標(biāo)。MDA，APX，POD，CAT活性均采用試劑盒（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)）測定。各指標(biāo)數(shù)據(jù)處理的方差分析數(shù)值為缺氮組指標(biāo)-對照組指標(biāo)。

2 數(shù)據(jù)處理分析

采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析與多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 1029份青稞材料表型耐貧瘠性評價

氮脅迫處理14 d后，青稞幼苗生長狀況出現(xiàn)顯著差異。利用K-均值聚類算法，依據(jù)各材料幼苗在氮脅迫下的死亡比例將各材料耐低氮性劃分為強(qiáng)、較強(qiáng)、中、較弱、弱5級。本試驗(yàn)按表1所示標(biāo)準(zhǔn)劃分青稞幼苗耐低氮性等級，其中強(qiáng)耐低氮性等級材料為9個，占全部材料比例的0.87%；耐低氮性較強(qiáng)的材料占比4.47%；耐低氮性占比43.54%；較弱占48.49%；弱耐低氮性占2.62%。圖1-圖2為4份耐貧瘠材料和4份缺氮敏感材料處理14 d之后的青稞長勢照，從圖中可以看出耐貧瘠材料的長勢強(qiáng)于缺氮敏感材料的長勢。

表1 青稞苗期耐低氮性等級劃分

圖1 4份青稞耐低氮材料處理14之后表型鑒定照

圖2 4份青稞缺氮敏感材料處理14后表型鑒定照

3.2 60份青稞品種（系）缺氮脅迫株高、根長變化量

60份材料通過14 d缺氮處理后發(fā)現(xiàn)，30份耐貧瘠材料和30份缺氮敏感材料在同一水平缺氮處理?xiàng)l件下，30份耐貧瘠材料的株高、根系均高于缺氮敏感材料。株高、根系變化量越大，說明處理影響越大。也印證了室內(nèi)鑒定結(jié)果：“ZDM4700”“藏1446”“ZDM5713”和“ZDM5766”變化量小，影響小，有一定的耐受性（圖1）。

植株高度是反映作物生長狀況和評價高產(chǎn)的主要指標(biāo)之一［24］。用對照組和缺氮組的株高變化量進(jìn)行分析，以此選出耐貧瘠的品種和對氮素敏感的品種。根據(jù)2組株高均值（圖3）和方差分析可知，對照組和缺氮組青稞的植株高度差值存在差異，尤其是缺氮處理?xiàng)l件下對照組的植株高明顯高于缺氮組品種，表明缺氮脅迫對氮敏感品種植株生長的影響較大，即這些青稞對氮素缺失敏感。從圖3可以看出對照和缺氮的植株高根系之間差異不明顯，但是不管是缺氮處理或?qū)φ仗幚項(xiàng)l件，耐低氮材料的根系要大于缺氮敏感材料，表明缺氮脅迫對氮敏感品種植株根系生長的影響較大，即青稞對氮素缺失敏感。

圖3 30份耐低氮青稞材料和30份缺氮敏感材料在缺氮處理?xiàng)l件下株高、根長的變化量

3.3 60份青稞品種（系）缺氮脅迫葉片、根系鮮質(zhì)量和干質(zhì)量變化量

60份材料通過14 d天缺氮處理后發(fā)現(xiàn)，地上地下葉片、根系鮮質(zhì)量和干質(zhì)量變化量越大，說明處理影響越大。60份材料處理后發(fā)現(xiàn)，30份耐貧瘠材料的葉片鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均大于30份缺氮敏感材料，而根系鮮質(zhì)量和干質(zhì)量之間的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4）。

生物量干質(zhì)量和鮮質(zhì)量是鑒定植物耐貧瘠性的形態(tài)指標(biāo)，一般認(rèn)為在缺氮條件下，耐貧瘠性強(qiáng)的植株干質(zhì)量要大一些［25］。根據(jù)對照組和缺氮組青稞地上生物量鮮質(zhì)量和地上生物量干質(zhì)量的均值（圖4）及方差分析可知，對照組和缺氮組青稞的地上生物量的差值的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，30份耐低氮材料在2組處理?xiàng)l件下的葉片干質(zhì)量和鮮質(zhì)量均大于缺氮敏感材料的葉片鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，而60份青稞材料地下生物量鮮質(zhì)量和干質(zhì)量之間的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明缺氮處理脅迫對青稞地上生物量的影響更高于地下生物量的影響。其中耐低氮材料“ZDM4700”“藏1446”“ZDM5713”“ZDM576”和“ZDM5544”的對照組的地上生物量的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的差值均大于缺氮敏感材料“藏0603”“藏0801”“ZDM5766”和“昆侖15”，而2組處理地下生物量之間的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 30份耐低氮青稞材料和30份缺氮敏感材料在缺氮處理?xiàng)l件下葉片、根的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量變化

3.4 60份西藏青稞品種（系）缺氮脅迫生理指標(biāo)鑒定結(jié)果

測試了過氧化物酶（POD）、APX（抗壞血酸過氧化物酶）、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA）活性。MDA含量的高低是反映質(zhì)膜破壞程度和細(xì)胞膜脂過氧化作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。60份材料通過缺氮環(huán)境處理之后發(fā)現(xiàn)，30份耐貧瘠材料和30份缺氮敏感材料MDA，CAT，POD和APX含量之間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，缺氮敏感材料“ZDM5766”“ZDM5626”“ZDM4618”“ZDM4394”缺 氮 培 養(yǎng) 后MDA，POD含量均高于耐貧瘠材料ZDM4492、ZDM5724、ZQ336，說明組織遭受逆境傷害的程度大，組織中存在老化、衰弱。缺氮敏感材料CAT含量均低于耐貧瘠材料，說明組織抗氧化防御機(jī)理越低。APX含量之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

MDA含量的高低是反映質(zhì)膜破壞程度和細(xì)胞膜脂過氧化作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。由表4可知，在缺氮脅迫下，缺氮處理組和對照組葉片的MDA含量差值存在差異，缺氮敏感材料“ZDM5766”“ZDM5626”“ZDM4618”“ZDM4394”的MDA含量均高于耐低氮青稞材料的值。說明青稞材料在缺氮處理?xiàng)l件下組織遭受逆境傷害的程度大，對缺氮脅迫敏感。在耐低氮品種中，“ZDM4700”“ZDM4492”“ZDM5724”“ZQ336”等的缺氮處理組青稞葉中POD活性顯著高于對照組的。植物在非生物逆境條件下細(xì)胞內(nèi)部活性氧的含量有所提高，因此會損害生物膜系統(tǒng)，而以上幾個品種生物膜損害程度較小，表明POD在缺氮脅迫條件下維持青稞細(xì)胞中活性氧的代謝平衡起著重要作用。

由表4可知，在耐低氮品種中，“ZDM4700”“ZDM4492”“ZDM5724”“ZQ336”的葉片生物膜損害程度較小，且缺氮脅迫青稞葉中APX活性高于對照組青稞葉中APX的活性。由此可證明，“ZDM4700”“ZDM4492”“ZDM5724”“ZQ336”等 品種響應(yīng)貧瘠環(huán)境依靠抗壞血酸過氧化物酶。

此外，由表4可知，在缺氮脅迫敏感的品種中，“ZDM5766”“ZDM5626”“ZDM4618”“ZDM4394”的缺氮處理組青稞葉中CAT活性明顯低于對照組。而CAT是清除過氧化氫的主要酶類，由此可知“ZDM5766”“ZDM5626”“ZDM4618”“ZDM4394”品種響應(yīng)貧瘠環(huán)境需要依靠CAT酶的調(diào)節(jié)作用。

表4 30份耐低氮青稞材料和30份缺氮敏感材料在缺氮環(huán)境處理后POD，APX，CAT和MDA含量比較

通過生長指標(biāo)和生理指標(biāo)的測定綜合比較分析30份耐貧瘠材料和30份缺氮敏感材料，試驗(yàn)獲得“ZDM4700”“ZDM5544”耐 貧 瘠 性 能 最 好，“ZDM5766”“昆侖15”為缺氮脅迫敏感型。

4 結(jié)論

近年來，由于一些自然條件和人為因素造成了土地資源損失，使土壤貧瘠化，而氮素是土壤中不可或缺的營養(yǎng)元素之一［26］，也是影響作物生長發(fā)育及產(chǎn)量形成最重要、最活躍的養(yǎng)分因子之一［27］。植物在缺氮條件下，含氮物質(zhì)的合成減少，影響植物細(xì)胞的分裂和伸長，從而導(dǎo)致植株矮小瘦弱、葉片變小、葉色變淡，進(jìn)而影響光合作用對有機(jī)物的積累過程，最終影響產(chǎn)量［28］。不同植物由于對逆境環(huán)境的響應(yīng)不同和自身遺傳性的差異會表現(xiàn)出生長速度的差異性［29］。大量研究表明，地上部與地下部生長量、地上部的鮮質(zhì)量與干質(zhì)量、地下部的鮮質(zhì)量與干質(zhì)量是衡量植物生產(chǎn)性能和抗性的重要生長指標(biāo)［30］。根系生長量、地下部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量對于氮素的缺失表現(xiàn)出的狀態(tài)最為明顯。此外，生物質(zhì)干質(zhì)量是鑒定植物耐貧瘠性的形態(tài)指標(biāo)，一般認(rèn)為在缺氮條件下，耐貧瘠性強(qiáng)的植株干質(zhì)量要大一些［31］。植株高度是反映植物生長狀況和評價高產(chǎn)的主要指標(biāo)之一［32-33］。因此，本研究中主要以株高變化量、地上生物量的鮮質(zhì)量及干質(zhì)量這3個指標(biāo)作為青稞在缺氮脅迫下耐貧瘠與否的生長指標(biāo)，在對其耐貧瘠性進(jìn)行評價的基礎(chǔ)上，對篩選得到的差異顯著的60個品種（30個耐貧瘠，30個缺氮敏感）進(jìn)行氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA）活性含量測定，用以衡量初篩的準(zhǔn)確性。本研究發(fā)現(xiàn)，60份青稞在缺氮脅迫下生長指標(biāo)存在具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異（p<0.05），其生長狀態(tài)部分地反映了60份青稞對貧瘠土壤的適應(yīng)性，而關(guān)于磷、鉀及其他元素對青稞的影響有待進(jìn)一步研究。60份材料通過缺氮環(huán)境處理之后發(fā)現(xiàn)，30份耐貧瘠材料和30份缺氮敏感材料的MDA，CAT，POD和APX含量之間的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，缺氮敏感材料“ZDM5766”“ZDM5626”“ZDM4618”“ZDM4394”缺氮培養(yǎng)后MDA和POD含量均高于耐貧瘠材料“ZDM4492”“ZDM5724”“ZQ336”，說明組織遭受逆境傷害的程度大，組織中存在老化和衰弱。缺氮敏感材料CAT含量均低于耐貧瘠材料，說明組織抗氧化防御機(jī)理越低。APX含量之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。氮脅迫處理后所有青稞品種葉片APX活性變化敏感，但關(guān)于青稞葉片APX活性對氮素的響應(yīng)機(jī)制尚不清楚，還需要在以后加強(qiáng)研究。通過生長指標(biāo)結(jié)合生理指標(biāo)本試驗(yàn)獲得9個苗期強(qiáng)耐低氮性青稞材料和27個苗期弱耐低氮性青稞材料，包括品種“ZDM4700”“藏1446”“藏0603”“昆侖14”等。本試驗(yàn)采用水培法控制氮元素的含量，設(shè)缺氮和適氮（對照和CK）2個處理。按照Hoagland溶液配方［20］配制不同營養(yǎng)液對青稞幼苗進(jìn)行處理，調(diào)查第14 d各材料幼苗死亡率，從而獲得苗期耐低氮青稞材料。由于作物不同生育時期耐低氮能力不同，接下來還需進(jìn)行青稞不同生育時期耐低氮性試驗(yàn)，對本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。