基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的健脾消積方治療肝癌的作用機制研究*

謝小慧，韓志偉，王宗玉，陳欣欣，仇雯霞，陳 闖△

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

根據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，肝癌發(fā)病率在我國癌癥發(fā)病率中排第5 位，死亡情況排在第2 位，是威脅我國人民生命健康和影響生活質(zhì)量的重大疾病[1]。肝癌的發(fā)生發(fā)展是多種因素綜合作用的結(jié)果，因此如何控制肝癌的生長與轉(zhuǎn)移，是目前治療肝癌主要的研究方向和急需解決的問題。通過近年來的研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的中草藥被發(fā)現(xiàn)有一定的抗腫瘤治療效果，臨床上也常用來輔助化療和提高腫瘤患者的身體抵抗力[2]。健脾消積方是本院對肝癌進行研究的主要方劑，同時也是我科在臨床上用于治療肝郁脾虛證的經(jīng)驗方，該方由黃芪、太子參、薏苡仁、茯苓、枳殼、莪術(shù)、麥芽、白花蛇舌草、青皮、陳皮、白術(shù)11 味中藥組成療效確切，可改善肝癌晚期患者的臨床癥狀，緩解疼痛，提高患者的生活質(zhì)量[3]。體外實驗研究證實健脾消積方水提物可以抑制肝癌細胞的增殖，促進肝癌細胞的凋亡[4]，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機制尚不清楚。因此，本文擬用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法來研究健脾消積方治療肝癌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，以期為健脾消積方的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 健脾消積方活性化合物及靶點篩選 本研究將健脾消積方的組成藥物黃芪、太子參、薏苡仁、茯苓、枳殼、莪術(shù)、麥芽、白花蛇舌草、青皮、陳皮、白術(shù)為關(guān)鍵詞輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMSP（2.3 version，https://tcmspw.com/tcmsp.php），結(jié)合中藥發(fā)揮藥效在人體會經(jīng)過吸收分布代謝和排泄的過程，以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，選取化合物和靶點[5]。再將獲得的靶點蛋白名導(dǎo)入到uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）當(dāng)中，設(shè)置物種為“Homo sapiens”獲取標(biāo)準(zhǔn)基因名，獲取日期為2021年3月。

1.2 健脾消積方治療肝癌的關(guān)鍵靶點篩選 在OncoDB.HCC 數(shù)據(jù)庫(http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw/)和Livercome 數(shù)據(jù)庫(http://liverome.kobic.re.kr/)中檢索獲取肝癌相關(guān)作用靶點，檢索日期為2021年3月。并將獲得的疾病靶點和“1.1”項中獲得的化合物靶點導(dǎo)入Venny（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）當(dāng)中，取交集得到健脾消積方治療肝癌的潛在作用靶點。

1.3 “化合物－靶點”網(wǎng)絡(luò)連接構(gòu)建 將健脾消積方治療肝癌的關(guān)鍵靶點和相對應(yīng)的化合物在excel表格中整理后導(dǎo)入Cytoscape3.7.0軟件作圖，并使用Network Analyzer插件進行分析。

1.4 關(guān)鍵靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將健脾消積方和肝癌的共同靶點導(dǎo)入STRING（11.0 version，https：//string-db.org）數(shù)據(jù)庫中，選擇“Homo sapiens”為研究物種，在設(shè)置欄目當(dāng)中將置信度設(shè)置為默認的“medium confidence0.4”，剔除無相互連接的蛋白，將結(jié)果以TSV 格式保存，導(dǎo)入Cytoscape3.7.0 分析作圖，得到關(guān)鍵靶點蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO功能分析和KEGG通路富集分析 通過高通量的生物數(shù)據(jù)功能分析挖掘工具DAVID 數(shù)據(jù)庫（6.8 version，http://david.nifcr.gov/)對健脾消積方得到的關(guān)鍵靶點進行基因功能GO富集分析和KEGG通路富集分析，以P＜0.001 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)入Excel表格整理作圖可視化。

1.6 “成分－關(guān)鍵靶點－通路”網(wǎng)絡(luò)圖繪制 篩選“1.5”項中通過關(guān)鍵靶點進行KEGG 富集分析得到的信號通路，結(jié)合“1.4”項中的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建篩選出來的前15 個關(guān)鍵靶點和“1.3”項中獲得的成分，繪制“成分－關(guān)鍵靶點－通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 健脾消積方化學(xué)成分和靶點 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 為基準(zhǔn)篩選健脾消積方各成分，去除無靶點預(yù)測的化合物，得到黃芪化合物有16 個、太子參有6 個、薏苡仁有6 個、茯苓有6個、枳殼有5個、莪術(shù)有1個、麥芽有15個、白花蛇舌草有5 個、青皮有5 個、陳皮有5 個、白術(shù)有4 個。將得到的中藥化合物合并去重，最終得到58個化合物和205個靶點。

2.2 健脾消積方治療肝癌的共有靶點 通過數(shù)據(jù)庫中檢索得到肝癌相關(guān)靶點503個。將健脾消積方化合物對應(yīng)的205個靶點和肝癌相關(guān)的503個靶點合并去重，得到62 個健脾消積方作用于肝癌的靶點。

2.3 “化合物—靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將健脾消積治療肝癌的62個共有靶點以及作用于這些靶點的44個化合物導(dǎo)入Cytoscape 中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)互作圖，見圖1。結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點數(shù)為106個，相互連接的邊的數(shù)目為223條。兩個節(jié)點之間連接的邊數(shù)代表度值（degree），節(jié)點與節(jié)點連接的邊數(shù)越多degree 值越大，相應(yīng)的該節(jié)點在該網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要。其中，degree 值排名靠前的化合物有槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、柚皮素（naringenin），degree值分別為23、23、11。這些化合物很可能是健脾消積方治療肝癌的主要藥效物質(zhì)。

圖1 健脾消積方化合物－靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將健脾消積方可能治療肝癌的62 個共有靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，再將STRING數(shù)據(jù)庫得到的靶點互作數(shù)據(jù)以excel 表格形式導(dǎo)入Cytoscape 軟件分析可視化，見圖2。網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡(luò)的平均degree 值為25.42，平均介數(shù)（betweeness)為0.01，平均接近中心性(closeness)為0.632 5，其中，degree、betweeness 和closeness 都超過平均值且排在前15 位的蛋白有TP53、EGFR、VEGFA、MYC、CASP3等，見表1。這些蛋白很可能是健脾消積方治療肝癌的關(guān)鍵靶點。

表1 健脾消積方治療肝癌關(guān)鍵靶點基本信息

圖2 健脾消積方治療肝癌PPI靶點圖

2.5 健脾消積方治療肝癌GO富集分析 為了研究健脾消積方治療肝癌靶點參與的生命過程，本研究將健脾消積方和肝癌共有的62個靶點導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫進行GO 富集分析，GO 富集分析包括三部分，生物學(xué)過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）。根據(jù)富集的靶點基因數(shù)（genecount)從大到小進行排序并選取前10 條進行繪圖。該網(wǎng)絡(luò)主要的BP 涉及細胞凋亡的調(diào)控（regulation of apoptosis）、細胞增殖的調(diào)控（regulation of cell proliferation）、細胞內(nèi)信號級聯(lián)（intracellular signaling cascade）等，CC主要涉及細胞核（nucleus）、細胞質(zhì)（cytoplasm）、質(zhì)膜（plasma membrane）等，MF 主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合（identical protein binding）、核苷酸結(jié)合（nucleotide binding）、蛋白質(zhì)二聚活性（protein dimerization activity）等，見圖3。

圖3 GO富集分析

2.6 健脾消積方治療肝癌的KEGG 通路分析 取PPI 網(wǎng)絡(luò)中的前15 個蛋白進行KEGG 通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15 個關(guān)鍵蛋白靶點富集在63 條通路上，其中P＜0.001 顯著富集的有37 條通路，選取與肝癌相關(guān)的前10 條信號通路進行繪圖。15 個關(guān)鍵靶點顯著富集在與肝癌相關(guān)的通路上，如PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、P53信號通路等，見圖4。

圖4 KEGG富集分析

2.7 “成分－關(guān)鍵靶點－通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape 3.7.0 軟件繪圖，槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、柚皮素（naringenin）這3 個化合物涉及的關(guān)鍵靶點數(shù)目最多，健脾消積方可能主要是由這3個成分來發(fā)揮藥效的。這些化合物同時又通過CASP3、EGFR、TP53 等多個靶點協(xié)同作用于PI3KAkt、TP53、MAPK等多條信號通路，見圖5。

圖5 健脾消積方成分－關(guān)鍵靶點－通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選出了健脾消積方治療肝癌可能的中藥成分和作用靶點，并對其可能的作用機制進行了探索。通過構(gòu)建“化合物－靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，健脾消積方中度值靠前的化合物有槲皮素、木犀草素、柚皮素等，這些成分可能是健脾消積方主要的藥效成分。

通過構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)可知，degree、betweeness 和closeness 都超過平均值的蛋白有TP53、CASP3 等，這些靶點可能是健脾消積方作用于肝癌最為關(guān)鍵的靶點。TP53 作為一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，控制著DNA復(fù)制和修復(fù)、對維持基因組的穩(wěn)定性以及與細胞周期進展和程序性細胞死亡密切相關(guān)[6]。有研究表明，TP53的激活可以調(diào)控MicroRNA的表達從而影響肝癌的細胞周期進展，增殖、凋亡和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[7]。CASP3 是Caspase 家族中與細胞凋亡關(guān)系最密切的蛋白酶，在所有與細胞凋亡的激活和執(zhí)行有關(guān)的蛋白質(zhì)中，發(fā)揮著不可替代的作用[8]。CASP3 在肝癌組織中低表達可以抑制細胞凋亡[9]。另有研究表明，許多中藥及其提取物可上調(diào)CASP3在肝癌細胞中的表達從而誘導(dǎo)細胞凋亡[10]。

本研究將前15 個關(guān)鍵靶基因進行KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)健脾消積方治療肝癌主要涉及PI3KAkt、P53 等信號通路。其中，PI3K/Akt 信號通路的作用包括促進細胞的生長、遷移、促進細胞的增殖和生存、促進血管生成以及下調(diào)周期抑制性調(diào)控因子等，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[11]。有研究表明，槲皮素可以通過刺激AKT/mTOR通路誘導(dǎo)細胞自噬從而誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡[12]。木犀草素可以通過PI3K/Akt 通路抑制HepG2 細胞的侵襲[13]。柚皮素可以通過PI3K/Akt/ERK 等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制肝癌細胞的遷移和侵襲[14]。p53 是重要的腫瘤抑制因子，通過刺激p53 信號通路可以激活其下游Caspase-3、Bax 等因子的表達從而引起細胞周期阻滯、誘導(dǎo)細胞凋亡[15]。有研究報道，槲皮素可以抑制大鼠肝癌細胞的生長，增殖、阻滯其細胞周期進程，從而誘導(dǎo)凋亡。其機制可能與調(diào)控p53 和CASP3蛋白的表達有關(guān)[16]。Yee等[17]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可以抑制肝癌細胞的增殖，將其阻滯于細胞周期G1期從而誘導(dǎo)細胞凋亡，并發(fā)現(xiàn)其機制可能與p53 信號通路的調(diào)控有關(guān)。柚皮素通過抑制HepG2 細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡從而抑制HepG2細胞的生長，其機制與增加Bax/Bcl-2的比值、釋放細胞色素C和上調(diào)p53、Caspase-3的表達，激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)[18]。進一步通過構(gòu)建“成分－關(guān)鍵靶點－通路”網(wǎng)絡(luò)圖分析發(fā)現(xiàn)，槲皮素、木犀草素和柚皮素涉及的關(guān)鍵靶點數(shù)目最多，且這3 個成分的共有靶點為CASP3，結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)和KEGG富集分析結(jié)果，筆者推測，健脾消積方可能主要是通過PI3K/Akt通路調(diào)控下游的TP53，再作用于TP53 信號通路的CASP3蛋白，從而誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，抑制肝癌的進展。

中藥復(fù)方發(fā)揮療效的機制復(fù)雜，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測了健脾消積方的主要起效成分，關(guān)鍵靶點和關(guān)鍵的信號通路，體現(xiàn)了健脾消積方治療肝癌多成分、多靶點、多通路綜合作用的特點。但健脾消積方治療肝癌的作用機制是否與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的結(jié)果一致，未來需要進一步的體內(nèi)和體外實驗驗證。