小蓬竹根際土壤微生物及內生真菌多樣性分析

陳 夢,陳敬忠,劉濟明,*,武夢瑤,顏 強,李 鵬,黃路婷,肖雪峰

1 貴州大學林學院, 貴陽 550025

2 貴州省社會工業(yè)研究所, 貴陽 550025

3 貴州省山地資源研究所, 貴陽 550025

自然界中,植物常常與特定微生物(細菌、真菌、放線菌等)生活在一起,形成一個緊密的植物-微生物復合群落[1]。植物-微生物復合群落對于雙方的生存和繁衍都具有重要意義,很多叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)、內生真菌(Endophytic fungi)、細菌(Bacteria)對植物生長發(fā)育有著不可忽視的作用[2-4],能夠促進植物對土壤中氮、磷和水分利用等方式來促進植物的生長[5],同時植物體又能夠為這些微生物提供寄宿場所和生長所需的能源[6- 7]。而根際作為自然界各種化學營養(yǎng)物質進入植物根部參與植物生長過程中物質循環(huán)的樞紐,承載著土壤、植物根系與微生物之間的相互作用[8- 9],因此對植物根際土壤微生物(細菌、真菌、放線菌)和植物內生真菌多樣性進行研究,有助于揭示植物對環(huán)境的適應性和植物與微生物的相互關系[10]。

根際土壤微生物(Rhizospheriv soil microbe)在植物根部微生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色,既要參與和驅動生態(tài)系統(tǒng)中植物體必須的營養(yǎng)元素與物質循環(huán),還要促進土壤中有機質的分解、植物根系對養(yǎng)分的吸收轉化和植物的生長發(fā)育,進而維持生態(tài)系統(tǒng)的健康。根際土壤微生物在特定的生境中會產(chǎn)生特定的“根際效應”來提高植物對外界不利環(huán)境的適應性,且在根部進行營養(yǎng)選擇和富集,從而提高根際微生物多樣性,增強植物在特定環(huán)境中的適應性[11],這種作用對植物在高鹽、干旱缺水等極端條件下生長良好有重要作用[12]。植物內生真菌是指以植物體某一組織為宿主,對植物生長發(fā)育和健康有顯著影響,通過幫助植物抵抗病蟲害提高抗逆性的一類微生物[13]。研究表明,不同種類的內生真菌由于對養(yǎng)分的需求不同,其生活方式與生存環(huán)境也有所不同,所以盡管在同一植株不同部位間內生菌多樣性也存在較大的差異,這種差異稱之為內生真菌的“組織專一性”[14]。

小蓬竹AmpelocalamusluodianensisT. P. Yi & R. S. Wang系禾本科Poaceae竹亞科懸竹屬(Ampelocalamus)植物[15],僅分布于貴州省羅甸、平塘、紫云和長順等喀斯特山地,是典型的喀斯特物種,常成片生長于海拔600—1000 m的石灰?guī)r裸露石山[16]。雖然小蓬竹分布區(qū)域十分狹窄,立地條件較差,但在其主要分布區(qū)均生長良好[17-19]。部分研究表明植物根際土壤微生物(細菌、真菌、放線菌)和內生真菌能夠增強宿主植物抗逆性和對土壤肥力利用,進而改善其宿主植物生存狀況[20- 21]。小蓬竹在土壤條件較差的喀斯特山地依舊能生長良好,是否與其微生物群落功能具有密切聯(lián)系,是一個值得探索的問題。結合可培養(yǎng)微生物的優(yōu)點,本文對小蓬竹根際土壤微生物(細菌、真菌、放線菌)和不同器官(根、莖、葉)內生真菌可培養(yǎng)部分多樣性進行研究,有助于了解微生物-植物群落緊密的內在關系,同時在一定程度上可揭示小蓬竹對喀斯特特殊生境的適應性機理,同時純化分離得到的菌株也可為后期尋找小蓬竹相關耐性功能微生物奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

采樣點位于貴州省羅甸縣董架鄉(xiāng)打鳥槽,經(jīng)緯度為106°45′17″E、25°30′39″N,屬于典型南亞熱帶季風氣候。日照時數(shù)約1300—1500 h,年降水量約1000—1400 mm,海拔757 m。土壤為石灰土(pH 7.68),主要土壤酶活性分別為：過氧化氫酶 (8.74±0.01) g/min、蔗糖酶 (2.64±0.03) g/d、脲酶0.04 mg (NH3-N)/g/d(實測值)。

1.2 實驗材料

于采樣點(羅甸縣董架鄉(xiāng))沿等高線按一定距離設置5個樣方(5 m ×5 m),每個樣方隨機選擇10株母竹,將竹叢整叢挖出,采集健康植株根、莖、葉3部分樣品(莖部分混合上中下3個部位),使用抖落法采集附著于根系2 mm根際土壤。將各樣方采集的10株植株分別按根、莖、葉均勻混合,置于4 ℃冰盒低溫保存及時帶回實驗室處理。所需培養(yǎng)基為：25%雙抗PDA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、馬丁氏-孟加拉紅培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、改良高氏1號培養(yǎng)基(所有培養(yǎng)基均購買自上海博微生物科技有限公司)[22]。

1.3 微生物的分離培養(yǎng)

1.3.1根、莖、葉內生真菌的分離

將根、莖、葉用無菌水將表面附著的土壤洗凈,用無菌刀切割成4 mm×4 mm大小的組織塊。在無菌操作臺內將組織塊于75% 酒精浸泡1 min后無菌水沖洗3次,隨后用2.5% 次氯酸鈉溶液消毒1 min后再放入75% 酒精浸泡30 s,使用去離子無菌水沖洗5次后無菌濾紙擦干。將組織塊兩端削后接種在25% 雙抗PDA培養(yǎng)基,在優(yōu)化后的每個平板上的6個瓊脂塊各接1個組織塊,每個處理10個重復,然后置于26 ℃ 的生化培養(yǎng)箱內恒溫培養(yǎng)(采用組織印跡法、漂洗液涂布法及空白對照法檢測操作環(huán)境和組織表面是否消毒干凈,保證分離到的為“內生菌”)[22- 24]。隨時觀察組織切口是否有菌絲長出,待菌絲長出后及時轉接至PDA培養(yǎng)基,純化2—3次后獲得單一菌株[20-21]。

1.3.2土壤真菌、細菌、放線菌的分離

使用稀釋平板涂抹法,取10 g新鮮土樣轉入90 mL無菌水中,在搖床上振蕩30 min充分混勻(200.0 rpm,25 ℃)。使用移液槍吸取混勻后的土樣溶液1 mL,轉入裝有9 mL無菌水的試管中,獲得濃度為10-2的稀釋土樣。(1)真菌：使用孟加拉紅培養(yǎng)基(加100 U/mL青霉素和慶大霉素160 U/mL抑制細菌生長),置于生化培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)5 d,每日觀察菌落生長情況,一旦發(fā)現(xiàn)菌絲長出立即挑取單菌落邊緣菌絲接種至新的PDA培養(yǎng)基,重復2—3次直至獲得單一菌株。(2)細菌：使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,置于生化培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)2—7 d,待菌落長出后立即挑取形態(tài)、顏色、質地等不同的單菌落劃線于新的平板培養(yǎng)直至獲得純菌株。(3)放線菌：使用改良高氏1號培養(yǎng)基,置于生化培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)7 d；純化方法同真菌,所有處理在純化2—3次后獲得單一菌株[25- 26]。

1.4 菌種鑒定

使用Ezup柱式(離心柱型,50 PREPS)真菌和細菌基因組DNA抽提試劑盒(生物工程(上海)股份有限公司)提取DNA,使用DNA純化試劑盒Kit Ver.2.0 (TaKaRa)進行純化,用1% 瓊脂糖凝膠(其中含有0.5 mg/L 溴化乙錠)電泳檢測DNA的質量。PCR擴增引物和程序如下：

(1)真菌：通用引物。序列為：ITS1-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA- 3′),ITS4-R(5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC- 3′)[27]。

表1 真菌擴增體系(50 μL)

(2)細菌、放線菌：通用引物。Bact-F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′),Bact-R(5′-CTACGGCTACCTT GTTALGA- 3′)[28]。

表2 細菌、放線菌擴增體系(50 μL)

擴增產(chǎn)物由英濰捷基(上海)貿易有限公司(Invitrogen) 采用ABI 3730xl測序,最后登陸NCBI GenBank通過BLAST比對測序結果,下載最相近的菌株序列(相似性大于97%),結合分子生物學證據(jù)鑒定菌株種類[25- 26]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

(1)真菌、細菌、放線菌多樣性：利用Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)(H)、均勻度指數(shù)(E)、Simpson指數(shù)(D)評價小蓬竹微生物多樣性,計算公式如下[29]：

H=∑(PilnPi) (Pi為第i種菌株數(shù)占全部菌株數(shù)的百分比)

D=1-∑(Pi)2(Pi為第i種菌株數(shù)占全部菌株數(shù)的百分比)

E=H/ln(S) (H為Shannon-Wiener指數(shù),S為物種總數(shù)目)

(2)系統(tǒng)發(fā)育樹的構建：利用Clustal X 2. 0軟件對下載的菌株序列進行匹配排列,用MEGA 6(鄰接法)和Figtree軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建與美化[29]。

(3)采用Origin 2018 對真菌、細菌、放線菌進行層次聚類分析和繪圖工作。

2 結果與分析

2.1 根際土壤微生物及不同器官內生真菌的組成

從小蓬竹根際土壤和根莖葉分離得到具有明顯形態(tài)差異的菌株200株,組成情況如下(圖1)：(1)土壤真菌與內生真菌菌株共139株,通過rDNA-ITS 序列比對歸屬27屬54種。根部分離得到的63個內生真菌菌株可歸到17個屬,優(yōu)勢屬為漆斑菌屬Myrothecium(12.70%)、鐮刀菌屬Fusarium(12.70%)、稻鐮狀瓶霉屬Harpophora(11.11%)。莖分離得到的14個內生真菌菌株可歸到8個屬,優(yōu)勢屬依次為彎孢聚殼屬Eutypella(14.29%)、肉座菌屬Hypcrea(14.29%)、擬莖點霉屬mitosporic(14.29%)、脈孢菌屬Neurospora(14.29%)、刺盤孢屬mitosporic(14.29%)、半殼霉屬Rhytismataceae(14.29%)。葉分離得到的28個內生真菌菌株可歸到9個屬,優(yōu)勢屬節(jié)菱孢霉屬Arthrinium(28.57%)、炭角菌屬Xylaria(21.42%)、毛殼菌屬Chaetomium(10.71%)。根際土分離得到的34個內生真菌菌株可歸到12個屬,優(yōu)勢屬依次為青霉菌屬Penicillium(20.59%)、曲霉屬Aspergillus(17.64%)、木霉屬Trichoderma(14.40%)、踝節(jié)菌屬Talaromyce(11.76%)、漆斑菌屬Myrothecium(11.76%)；(2)從根際土壤中分離得到41株細菌菌株可歸到7個屬,其中優(yōu)勢屬為芽孢桿菌屬Bacillus(70.73%)；(3)從根際土壤中分離得到的20株放線菌菌株全部歸屬于鏈霉菌屬Streptomyces。

圖1 小蓬竹根際土壤微生物及不同器官內生真菌相對多度

2.2 根際土壤微生物及不同器官內生真菌的系統(tǒng)發(fā)育關系分析

(1)真菌(圖2)：小蓬竹根、莖、葉、根際土壤總共分離得到139個真菌菌株均屬于子囊菌門。其中Trichodermavelutinum(EF596953.1)與Trichodermaspirale(KM011996.1)、Fusariumsp.WF150(HQ130706.1)和Fusariumredolens(EF495234.1)、Fusariumsp. LMG201(KJ598872.1)和Fusariumsp.C_1_BESC_294z(KC007281.1)、Hypocreanigricans(JN943369)和Hypocrearufa1(KC01245.1)、Fusariumsp. LMG20(KJ598872)和Fusariumsp. WF150(HQ130706)的支持率均達到100%,說明上述類群親緣關系較近。其余各個類群間支持率從4%到99%不等,親緣關系依次從遠到近。在分類水平上來看,糞殼菌綱Sordariomycetes處于絕對優(yōu)勢綱,占菌株總數(shù)的 76.08%,其余占比分別為散囊菌綱Eurotiomycetes 5.18%,座囊菌綱Dothideomycetes 3.62%、絲孢菌綱Hyphomycetes 2.17%、錘舌菌綱Leotiomycetes 1.4%、Agaricomycetes傘菌綱 0.74%；(2)細菌(圖3)：從根際土壤中分離得到40細菌菌株分別歸屬于厚壁菌門Firmicutes(29株)、變形菌門Proteobacteria(11株)、擬桿菌門Bacteroidetes(1株)。其中變形菌門中的Pseudomonasmonteilii和Pseudomonassp. JSPB3,Lysobactersp. R7- 567和Lysobactersp. BBCT65支持率菌達到了100%,說明上述兩者間親緣關系較近。其余支持率從21%—99%不等；(3)放線菌(圖4)：從根際土壤中分離得到的20株菌株均屬于鏈霉菌屬Streptomyces,分屬于15個種。支持率從7%—99%不等。

圖2 小蓬竹不同部位真菌系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 小蓬竹細菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 根際土壤微生物及不同器官內生真菌多樣性分析

由圖3可知,真菌多樣性指數(shù)中：Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)H依次為根2.652>根際土2.18>莖2.045>葉1.989,Simpson指數(shù)D依次為根0.919>根際土0.932>莖0.867>葉0.834,均勻度指數(shù)E依次為根際土0.89>莖0.775>根0.640>葉0.597。從多樣性的排序可以看出在Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H與Simpson指數(shù)D中最高的為根,最低的為葉,而在均勻度指數(shù)E中最高的為根際土,最低的為葉。從幾個多樣性指數(shù)的計算結果來看,根際土壤真菌的多樣性總體要高于不同器官(根莖葉)內生真菌的多樣性；根際土細菌多樣中：H指數(shù)為1.0679,Simpson指數(shù)D為0.5217,均勻度指數(shù)0.5488；根際土放線菌多樣中：H指數(shù)為2.63,Simpson指數(shù)D為0.08,均勻度指數(shù)0.9865。

2.4 根際土壤微生物及不同器官內生真菌群落相似性比較

通過對小蓬竹根際土壤微生物和各個器官內生真菌的種類構成進行層次聚類(距離采用歐式距離)分析后發(fā)現(xiàn)(圖6),根際土與不同器官的真菌組成首先單獨聚為一支,其中莖與葉先聚為一類,其后莖、葉與根聚為一類,最后根、莖、葉再與根際土聚為一類。從聚類結果可知,根、莖、葉真菌群落相似性較高,而根、莖、葉與根際土壤相似性較低。同時也反映出不同器官內生真菌的組成具有較高的相似性,而與根際土壤緊密接觸的根部內生真菌與根際土壤真菌具有一定相似性；根際土細菌和放線菌聚類距離與所有真菌相等,完整的將真菌、細菌、放線菌聚為3支。

圖6 小蓬竹根際土壤微生物與各個器官內生聚類分析結果

3 討論

物種多樣性指數(shù)是衡量物種數(shù)量的重要指標,通常在群落中物種越豐富,分布比例越均勻則物種群落的多樣性指數(shù)越高[30]。從小蓬竹根際土壤及不同器官微生物物種多樣性指數(shù)(圖2—圖4)來看：根和根際土的真菌多樣性指數(shù)最高,物種豐富度從下(根,根際土)到上(莖、葉)呈現(xiàn)出逐步降低的趨勢,這在刺槐Robiniapseudoacacia、重樓Parispolyphyllavar.chinensis等植物中也觀察到類似的現(xiàn)象[31- 32]。根際土壤細菌和放線菌物種多樣性相對較低,相關研究者認為可能是真菌群落受到土壤中N、P、K等元素影響造成[33]。小蓬竹根際土壤與根部內生真菌多樣性較高原因可能是由于在根與土壤接觸界面具有較多凋落物殘體(凋落的葉、枝條、死根)以及根際分泌物能夠為根際和根部真菌分解利用提供充足碳源和可利用元素,進而促進其豐富度的提高[30]。

圖4 小蓬竹放線菌系統(tǒng)發(fā)育樹

從根際土和植株不同部位微生物組成來看,真菌類群中的脈孢菌屬Neurospora、木霉屬Trichoderma在根際土、根、莖、葉內均有分布,其中木霉屬被認為是具有重寄生(fungal parasite)功能的生防菌[31],對許多植物病原菌都具有一定的拮抗作用[9,34],這對小蓬竹抵抗喀斯特地區(qū)不良環(huán)境具有重要意義；同時在小蓬竹根際土和根存在節(jié)菱孢霉屬Arthrinium和漆斑菌屬Myrothecium兩個共有屬,并且在根際土壤與根中均分離得到菌種Myrotheciumverrucaria。土壤微生物類群中,普遍存在著一類與植物共同進化并建立良好的共生關系促進植物生長發(fā)育的細菌群落(PEGR),諸如假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)等[35],這類細菌不僅可以誘導植物體自身產(chǎn)生抗生素抵御生物脅迫,而且還會通過產(chǎn)生激素和酶等信號分子,增強植株系統(tǒng)耐受性,同時促進植物對土壤中礦質營養(yǎng)元素的吸收,進而促進植物的生長[36-37]。小蓬竹根際土壤微生物與內生菌豐富的多樣性為其塑造了多樣的植物功能性狀,為其在喀斯特地區(qū)生長良好提供了必要的條件。

圖5 小蓬竹根際土壤微生物及不同器官內生真菌多樣性指數(shù)

根際及內生菌能夠促進植物營養(yǎng)元素的攝取[7],同時對植物次生代謝產(chǎn)物積累與產(chǎn)生具有重要影響[38-39],反之植物根系分泌產(chǎn)物又影響根際及內生菌的生長繁殖[2],根際土壤真菌及植物內生真菌的這些特性可以有效促進喀斯特地區(qū)植物在貧瘠土壤條件下對肥力資源的利用[38-41]；劉雯雯等[34]發(fā)現(xiàn)在喀斯特灌木演替階段,土壤真菌的優(yōu)勢屬為木霉屬、青霉屬等,而作為竹灌的小蓬竹在根際土壤真菌優(yōu)勢屬組成與上述結果具有較大的相似性。同樣小蓬竹內生真菌中的青霉屬Penicillium鐮刀菌屬Fusarium等菌屬在植物耐受喀斯特地區(qū)鈣脅迫和抵御病原菌侵染方面具有重要作用[40-43]。根際土壤細菌類群中的芽孢桿菌屬Bacillus、貪銅菌屬Cupriavidus被證實能夠促進植株對土壤中K元素的利用,這對于喀斯特小蓬竹適應喀斯特地區(qū)貧瘠的環(huán)境具有重要意義[44-45]。相關學者對于喀斯特地區(qū)放線菌的研究也發(fā)現(xiàn)主要以鏈霉菌屬Streptomyces為主[46-48]。上述菌屬的存在可位揭示小蓬竹對喀斯特地區(qū)環(huán)境適應性奠定基礎,但具體機制機理尚需進一步對分離的相應菌種進行相關功能試驗。

4 結論

研究表明,從喀斯特地區(qū)特有植物小蓬竹根際土壤及根、莖、葉共分離得到139株真菌菌株,歸屬于27屬,其中根際土壤34株為12屬,青霉菌屬Penicillium為優(yōu)勢屬；根部63株為17屬,漆斑菌屬Myrothecium、鐮刀菌屬Fusarium為優(yōu)勢屬；莖部14株為8個屬,彎孢聚殼屬Eutypella、肉座菌屬Hypcrea、擬莖點霉屬Mitosporic、脈孢菌屬Neurospora、刺盤孢屬mitosporic、半殼霉屬Rhytismataceae為優(yōu)勢屬；葉部28株劃分為9屬,節(jié)菱孢霉屬Arthrinium為優(yōu)勢屬。根際土壤分離得到細菌菌株41株,歸屬7屬,芽孢桿菌屬Bacillus為優(yōu)勢屬。放線菌菌株20株,均為鏈霉菌屬Streptomyces。

根際土壤真菌Shannon-Wiener 指數(shù)H為2.18,根、莖、葉內生真菌分別為2.652、2.045、1.989；Simpson指數(shù)D為：根際土壤真菌0.932,根0.919、莖0.867、葉0.834；均勻度指數(shù)E為：根際土壤真菌0.89,根0.640,莖0.775,葉0.597。根際土細菌Shannon-Wiener指數(shù)為1.0679,Simpson指數(shù)為0.5217,均勻度指數(shù)為0.5488。根際土放線菌Shannon-Wiener指數(shù)為2.63,Simpson指數(shù)為0.08,均勻度指數(shù)為0.9865。綜合三個多樣性指數(shù)表明小蓬竹根際土壤真菌多樣性較內生真菌多樣性高。