民族藥菠菜子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

謝莉 艾買提江?阿依甫別克 徐鴻 于新蘭

【摘 要】 目的： 對菠菜子藥材的安全性、有效性的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，為建立更完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。方法：對菠菜子藥材的性狀進(jìn)行鑒別;以 β-蛻皮甾酮為對照品對菠菜子藥材進(jìn)行 TLC 鑒別（薄層鑒別）;測定25 批菠菜子藥材的水分、總灰分、浸出物的含量;利用高效液相色譜法測定菠菜子藥材中 β-蛻皮甾酮的含量。結(jié)果：對菠菜子藥材的性狀進(jìn)行了描述;制定菠菜子藥材中 β-蛻皮甾酮的薄層色譜鑒別方法;暫定菠菜子藥材水分不得過 11.0%、總灰分不得過 6.0%、浸出物不得少于 8.0%。確定了菠菜子藥材中 β-蛻皮甾酮的含量測定方法，并根據(jù)結(jié)果暫定 β-蛻皮甾酮含量不得少于 0.07%。結(jié)論：通過研究制定了菠菜子藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到提高菠菜子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的目的，并為菠菜子炮制品及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和高效安全用藥提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 菠菜子;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);薄層色譜：含量測定

【中圖分類號】K29【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2021）07-0044-06

Research on Quality Standard Improverment for Ethnomedicine Spinacia Oleracea

XIE Li Amatijang Ayupbek XU Hong YU Xinlan

Xin Jiang Institute of Drug Control， Uumqi 83000，China

Abstract：Objective In order to improve reference for eastablishing more perfect quality standars for Spinacia oleracea L，to study the safety and effective quality standards.Method To identify the traits; as reference substance with β-ecdysterone on Thin layer chromatography （TLC）; The 25 batches of Spinacia oleracea L of moisture and total Ash、extractives were determined. Determination of β-ecdysterone of Spinacia oleracea L by High-performance liquid chromatography （HPLC）. Results The characters of Spinacia oleracea L were described and the TLC identification method was formulated; Check in formulating moisture was less than 11.0%、total 1ashes were less than 6.0%、extractives were more than 8.0%. A method for the determination of β-ecdysterone in Spinacia oleracea L was established， and based on the results， the content of-ecdysterone should be more than 0.07% .Conclosion The aim of improving the quality standard of Spinacia oleracea L medicinal materials was achieved by studying and formulating the quality standard of spinach seed medicinal materials， which provided the basis and guarantee for the quality standard of spinach seed processed products and its preparation and the high-efficient and safe drug use.

Key：words：Spinacia Oleracea L; Quality Standard;TLC Identification; Content Determination

菠菜來源于藜科菠菜屬植物菠菜Spinacia oleracea L，為藥食同源類植物，別名為波斯菜、赤根菜，系屬外來中藥資源，一般以其地上部分、果實和根入藥，現(xiàn)全國各地均有栽培[1-2]。菠菜子為菠菜的果實，又稱菠薐菜子，是維吾爾醫(yī)常用藥材，維吾爾語名為 Palek Urughi。主要用于異常膽液質(zhì)過剩、熱性傷寒、發(fā)燒不退、體弱、便秘、熱性心痛等疾病[3-4]。目前，菠菜子收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》維吾爾藥分冊中[5]，但該標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容簡單，僅對菠菜子的性狀和顯微進(jìn)行簡單描述，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)偏低，不足以控制本藥材的質(zhì)量。現(xiàn)有研究報道多為原植物種植方法、組織形態(tài)和藥理作用等方面[6]，目前國內(nèi)文獻(xiàn)未見有關(guān)菠菜子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究報道。因此，為促進(jìn)中藥民族藥產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，推動民族藥材標(biāo)準(zhǔn)化提高，故本研究對菠菜子的性狀、TLC 鑒別、水分、總灰分、浸出物及含量測定項目進(jìn)行研究，以期為菠菜子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和完善提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津（LC-20AT）高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器（日本島津公司）;JA 12002 型電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）;SK7210LHC 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）;成像顯微鏡（日本 OLYMPUS 公司）;冷凍切片機(jī)（ Thermo 公司）;GZX-9140MBE 型鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）;DZKW-D-6 型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）;KLZ-UP 型艾柯純水儀（臺灣艾柯，成都康寧試驗專用純水設(shè)備廠）。

1.2 試藥 乙醇（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號 20171008）;甲酸（分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號 20170703）;甲醇（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號 2018101012）;硅膠 G 薄層板（青島海洋化工分廠，批號 20170812）;乙腈（Fisher 公司，Lot 18356）;磷酸（天津永晟精細(xì)化工有限公司，批號 20160215）β-蛻皮甾酮對照品（批號 H918750）購自于加拿大多倫多 Toronto Research Chemical（TRC） 公司。

菠菜子藥材從市場上收集，共計25批，產(chǎn)地分布于新疆和田、安徽亳州、山東臨沂、甘肅隴西、河北安國等地，藥材基源由新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗研究院蘇來曼·哈力克主任藥師進(jìn)行鑒定為圓葉菠菜的果實，樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 菠菜子的外形與中藥蒺藜科蒺藜Tribulus terrestris L.干燥的果實外形相似，常被人混用[7]，目前常被視為蒺藜的偽品之一。故結(jié)合藥材實際性狀，本文對菠菜子性狀進(jìn)行了規(guī)范化的描述。菠菜子呈近或扁圓形，直徑 2～4 mm。表面淺綠色或灰白色，略粗糙，側(cè)面有 2～4個縱棱;一端圓形，中部有突起，另一端有稍尖的合點，帶有殘留的果柄或已脫落;果皮堅硬，種皮深棕色、光滑有光澤，種臍部凹陷，具一環(huán)狀縱溝;胚乳類白色，粉性。無臭，味淡。如圖1所示。

2.2 定性鑒別 菠菜子中含有黃酮類、甾體類等活性成分，其中甾體類活性成分分為植物甾醇類和昆蟲蛻皮激素等，植物甾醇主要含 α-菠菜甾醇、Δ7-豆甾烯醇、β-谷甾醇、蛻皮甾酮、羥基蛻皮激素等[8-10]，本試驗為菠菜子中 β-蛻皮甾酮進(jìn)行定性鑒別，并對展開劑、顯色劑、展開環(huán)境等色譜條件進(jìn)行了考察。

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品粉末 3g，加 80% 甲醇 5 mL，超聲處理 20 min，靜置，取上清液，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 取β-蛻皮甾酮對照品，加甲醇制成 1 mL含 0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 薄層色譜條件 分別吸取供試品溶液 10 μL，對照品溶液 5 μL，分別點于同一硅膠 G 薄層板上，選取三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（8∶2∶0.3∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 10% 硫酸乙醇溶液，在 105 ℃ 加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視，如圖2所示。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點，可用于菠菜子中 β-蛻皮甾酮的鑒別。不同采集地樣品色譜基本一致，說明該方法可靠穩(wěn)定。

2.3 檢查 水分和總灰分測定分別參照《中國藥典》2015 年版四部通則 0832 （第二法）和 2302 進(jìn)行試驗，檢驗結(jié)果見表 2。根據(jù)測定結(jié)果可得，樣品水分在 5.76%～10.06% 范圍內(nèi)，為 （8.37±1.37）%（n=25）;樣品總灰分在 4.27%～5.41% 范圍內(nèi)，為 （4.65±0.27）%（n=25），在各批次樣品測定值的基礎(chǔ)上上浮 20%，作為各指標(biāo)的上限，暫定菠菜子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中水分不得過 11.0%，總灰分不得過 6.0%。

2.4 浸出物 參照《中國藥典》 2015 年版四部中“藥材和飲片檢定通則（ 0212 ）”項下的浸出物測定法試驗。選取稀乙醇為提取溶劑，采用冷浸法提取菠菜子樣品中的浸出測定結(jié)果見表3。

由上表可知，樣品測定值范圍為6.65%～13.25%，實測值 （%） 為 （10.12±2.03）%（n=25），在各批次樣品測定值的基礎(chǔ)上下浮 20%，作為各指標(biāo)的下限，暫定菠菜子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中浸出物不得低于 8.0%。

2.5 含量測定[11-14]

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ODS C18 （250 mm×4. 6 mm，5 μm）;流動相：乙腈-0.02% 磷酸溶液（16∶84），流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：250 nm;柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

2.5.2 對照品儲備液的制備 精密稱取 β-蛻皮甾酮對照品 25.81 mg，置 20 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解，定容，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備 取菠菜子藥材粉末約 1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 80% 甲醇 25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用 80% 甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。除加樣品外以同法操作，制得空白溶液。結(jié)果如圖 3所示。

2.5.4 線性關(guān)系 從對照品儲備液中精密量取各溶液0.5 mL、1.0 mL、1.0 mL、2.0 mL和1.0 mL，分別置于 50 mL、50 mL、25 mL、25 mL和10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻，依法測定，以溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程：Y=14404×C-28065，r=0.9991。結(jié)果表明 β-蛻皮甾酮在 0.1290～1.2905 μg·mL-1（n=2） 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別在制備 0、2、4、6、8、12、14、18、24 和 32 h后，進(jìn)樣測定，測得 β-蛻皮甾酮含量的平均值為0.12%，RSD 為 0.78%。表明供試品溶液在室溫放置 32 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.6 加樣回收 取已知含量的樣品 0.5 g共9份，精密稱定，分別加入不同量濃度的對照品儲備液，按供試品方法處理;在250 nm波長下進(jìn)行含量測定，測得平均加樣回收率為 100.16%，RSD為 1.87%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。結(jié)果見表 4。

2.5.7 重復(fù)性 取同一供試品共 6 份，精密稱定，按供試品的處理方法處理，并在 250 nm 波長下進(jìn)行測定，測得樣品平均質(zhì)量濃度為 0.120%，RSD 1.50%（n=6）。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性好，測定方法可行。

2.5.8 樣品測定 取收集到的 25 批菠菜子藥材，精密稱定，按照“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件測定供試品中β-蛻皮甾酮的 含量，結(jié)果見表5。

根據(jù)25批樣品的測試結(jié)果，暫定本品按干燥品計算，含 β-蛻皮甾酮（C27H44O7），不得少于0.07%。

3 討論

3.1TLC鑒別 筆者同時對該方法進(jìn)行系統(tǒng)耐用性實驗，比較不同廠家（青島海洋化工有限公司、煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所及上海盛亞化工有限公）的 3 種硅膠 G 薄層板進(jìn)行比較，在不同濕度（25%、30%、40%）、不同溫度（18 ℃、25 ℃、30 ℃）時對實驗結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，供試品和對照品斑點均清晰，沒有本質(zhì)區(qū)別，說明該方法通用性較好。

3.2 浸出物考察 筆者采用不同濃度的（20%、40%、60%、80%、95%）乙醇溶液，分別用冷浸法和熱浸法對菠菜子的浸出物得率進(jìn)行考察，結(jié)果冷浸法得率較熱浸法高，且冷浸法中 20%～60% 乙醇提取時，浸出物得率差異不明顯。因此，選用稀乙醇為提取溶劑，采用冷浸法測菠菜子中浸出物。

3.3 供試品溶液的考察 分別對不同提取溶劑（70%、80%、90%、100%）甲醇和（70%、80%、90%、100% ）乙醇、不同提取時間（20 min、3 min、40 min）、不同提取方式（超聲提取、回流提取）、不同物料比（1∶25、1∶30、1∶40）進(jìn)行考察，結(jié)果表明：在80% 甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min，物料比為1∶25時，供試品中 β-蛻皮甾酮的含量最高。

3.4 HPLC測定結(jié)果 菠菜子中 β-蛻皮甾酮含量范圍在 0.073%～0.205%，其中產(chǎn)地為山東臨沂、甘肅隴西、安徽亳州、河北安國及河南南陽的5批菠菜子中β-蛻皮甾酮含量顯著高于產(chǎn)地為新疆和田的菠菜子。說明菠菜子中 β-蛻皮甾酮的含量高低可能與菠菜子的種植地有關(guān)，受種植環(huán)境的影響，β-蛻皮甾酮的含量會有所差異;也可能是由于這5批菠菜子采收時間較近，存放時間較短，造成含量有所差異。這為菠菜子的種植環(huán)境和存儲的要求提供了參考，具體含量差異原因，后期會進(jìn)一步深入研究。

4 小結(jié)

目前，國內(nèi)對菠菜的研究僅限于種植方法、原植物組織形態(tài)和藥理作用等方面，對菠菜及其果實中化學(xué)成分及其含量分析尚未見報道。筆者參照《中國藥典》2015年版一部牛膝藥材項的TLC鑒別和含量測定方法，建立菠菜子中β-蛻皮甾酮的TLC 鑒別和含量測定的方法，該方法簡便、可靠、重現(xiàn)性好，并根據(jù)25批樣品的測定結(jié)果，暫定本品按干燥品計，含β-蛻皮甾酮，不得少于0.07%，用于控制菠菜子藥材的質(zhì)量。本實驗研究旨在為菠菜子安全用藥和化學(xué)成分研究提供理論依據(jù)，為菠菜子藥材標(biāo)準(zhǔn)提高奠定基礎(chǔ)，也為更好的控制維藥的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。

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（收稿日期：2021-09-29 編輯：劉 斌）