卵巢上皮性癌中VEGF、CD4+、CD8+及COX?2表達(dá)與TIDC相關(guān)性

吳明燕 康雪芳 林月麗 林也容 張?zhí)m 黃麗玲 陳慧

作者單位：中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○九醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建，漳州363000

卵巢上皮性癌約占女性惡性腫瘤的3%～4%，具有高死亡率、高發(fā)病率的特點(diǎn)［1］。腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要危險(xiǎn)因素，目前已有研究證實(shí)，腫瘤快速生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移及免疫抑制有關(guān)［2］。T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在機(jī)體排斥腫瘤細(xì)胞時(shí)起主要作用，但腫瘤抗原只有經(jīng)抗原遞呈細(xì)胞的抗原遞呈后才能被T 淋巴細(xì)胞識(shí)別。當(dāng)今免疫學(xué)研究認(rèn)為，機(jī)體處于免疫激活或免疫抑制依賴于抗原呈遞細(xì)胞（Antigen presenting cell，APC）的抗原遞呈功能［3］。人體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職APC 為樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）。腫瘤組織局部浸潤(rùn)的DC 稱為腫瘤浸潤(rùn)性DC（Tumor invasive DC，TIDC），其能真實(shí)反映組織局部的免疫狀態(tài)［4］。組織中環(huán)氧合酶?2（Cyclooxygenase?2，COX?2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）等因子均與TIDC 的分化、成熟有關(guān)［5］。本研究將通過分析卵巢上皮性癌中VEGF、CD4+、CD8+及COX?2 表達(dá)與TIDC 的關(guān)系，探討卵巢上皮性癌局部免疫功能抑制的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2016年12月至2020年1月收治的110 例卵巢上皮性癌患者作為研究組。納入指標(biāo)：①均符合卵巢上皮性癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；②自愿參與本次研究，且簽署知情同意書者；③臨床資料無缺失或丟失；④未進(jìn)行化療、放療等治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心臟、肝腎功能不全；②神經(jīng)功能障礙者；③合并其他惡性疾??；④哺乳期婦女或妊娠期孕婦。平均年齡為（51.98±10.74）歲；臨床分期：Ⅰ期30 例，Ⅱ期33 例，Ⅲ期30 例，Ⅳ期17 例；病理類型：漿液性癌81 例，黏液性癌29 例；伴有腹水者41 例；病理分級(jí)G139 例，G237 例，G334 例。另同期選取進(jìn)行健康體檢的70 例女性體檢者作為對(duì)照組，平均年齡為（50.87±9.36）歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑

一抗均為濃縮型，鼠抗人S?100 單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Neomarkers 公司。鼠抗人VEGF、COX?2 單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。鏈酶菌抗生物素蛋白?過氧化物酶連接（SP）免疫組化超敏試劑盒、胰蛋白酶及二氨基聯(lián)苯氨酶底物顯色試劑盒，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.2 檢測(cè)方法

首先進(jìn)行標(biāo)本準(zhǔn)備：組織切片后脫蠟、水化。然后根據(jù)S?P 免疫組化染色法對(duì)S?100、VEGF 及COX?2 進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過程嚴(yán)格按照說明進(jìn)行。一抗陰性對(duì)照使用PBS（磷酸鹽緩沖液）進(jìn)行代替。

1.2.3 結(jié)果判斷［7］

根據(jù)S?100、VEGF 及COX?2 陽(yáng)性細(xì)胞百分比、染色強(qiáng)度判定。分為：0 分、1 分、2 分、3 分、4 分。染色強(qiáng)度判定：0 分：無色，1 分：淡黃色，2 分：棕黃色，3 分：棕褐色?？偡e分：上述2 項(xiàng)評(píng)分的乘積。陽(yáng)性：總積分>4 分。

1.2.4 T 淋巴細(xì)胞檢測(cè)

空腹抽取所有受檢者3 mL 靜脈血，3 500 r/min離心15 min，分離血清，取上清液，置于-80℃低溫保存待檢。采用貝克曼流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者外周血T 淋巴細(xì)胞亞群（CD4+、CD8+）。

1.2.5 TIDC 確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)［8］

TIDC 確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核與細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)可見明顯凸起；S?100 蛋白染色陽(yáng)性。TIDC 計(jì)數(shù)：由兩名或以上病理科醫(yī)師進(jìn)行閱片。低倍鏡下任選染色背景清晰處，然后在高倍鏡下任選5 個(gè)視野計(jì)數(shù)TIDC 總數(shù)，并計(jì)算其平均值，為TIDC 數(shù)密度。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組S?100 TIDC 及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+表達(dá)情況。②分析卵巢上皮性癌病理特征與TIDC 數(shù)密度及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+的關(guān)系。③分析VEGF、COX?2、CD4+、CD8+與TIDC 的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 法對(duì)各參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組S?100 及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+表達(dá)情況比較

研究組S?100 及VEGF、COX?2 陽(yáng)性表達(dá)率和CD4+、CD8+水平均顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1、圖1。

表1 兩組S?100 及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+表達(dá)情況［n（%），（±s）］Table 1 Expression of S?100 and VEGF，COX?2，CD4+、CD8+in two groups［n（%），（±s）］

表1 兩組S?100 及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+表達(dá)情況［n（%），（±s）］Table 1 Expression of S?100 and VEGF，COX?2，CD4+、CD8+in two groups［n（%），（±s）］

組別n S?100陽(yáng)性陰性VEGF陽(yáng)性陰性COX?2陽(yáng)性陰性CD4+CD8+對(duì)照組研究組t/χ2值P 值70 110 44（62.86）91（82.73）9.008 0.003 26（37.14）19（17.27）3（4.29）78（70.81）76.718<0.001 67（95.71）32（29.09）4（5.71）83（75.45）83.316<0.001 66（94.29）27（24.55）10.71±6.02 18.77±9.56 6.300<0.001 10.94±6.28 38.95±15.75 14.168<0.001

圖1 免疫組化染色圖（SP，×400）Figure 1 immunohistochemical staining（SP，×400）

2.2 卵巢上皮性癌病理特征與TIDC 數(shù)密度及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+的關(guān)系

臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有腹水者TIDC 數(shù)密度明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、無腹水者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、病理分級(jí)G3者VEGF、COX?2 陽(yáng)性表達(dá)率與Ⅰ～Ⅱ期、G1?G2級(jí)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。漿液性癌患者CD4+水平顯著高于黏液性癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有腹水及病理分級(jí)G3者CD8+水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、無腹水及病理分級(jí)G1?G2級(jí)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 卵巢上皮性癌病理特征與TIDC 數(shù)密度及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+的關(guān)系［（±s），n（%）］Table 2 The relationship between the pathological characteristics of epithelial ovarian cancer and the number density of TIDC，VEGF，COX?2，CD4+，CD8+［（±s），n（%）］

表2 卵巢上皮性癌病理特征與TIDC 數(shù)密度及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+的關(guān)系［（±s），n（%）］Table 2 The relationship between the pathological characteristics of epithelial ovarian cancer and the number density of TIDC，VEGF，COX?2，CD4+，CD8+［（±s），n（%）］

病理特征年齡n t值P值χ2值P值χ2值P值t值TIDC數(shù)密度9.17±2.07 9.71±2.28 8.45±1.56 8.62±1.74 9.74±1.07 9.35±1.48 10.19±2.74 8.04±1.77 7.56±1.26 10.84±3.04 8.15±1.47 8.06±1.14 P值t值VEGF陽(yáng)性47（72.30）31（68.89）35（74.47）43（68.25）58（71.60）20（68.97）31（49.21）47（100.00）28（68.29）50（72.46）44（57.89）34（100.00）P值0.4510.653 1.2870.201 COX?2陽(yáng)性49（75.38）34（75.56）37（78.72）46（73.02）60（74.07）23（79.31）38（60.32）45（95.74）30（73.17）53（76.81）51（67.11）32（94.12）3.3290.068 0.4730.491 CD4+14.27±9.77 15.21±4.86 13.56±8.54 12.89±7.98 18.03±8.21 14.98±10.56 17.25±12.37 16.54±11.05 15.97±9.54 14.65±8.06 17.68±12.94 16.99±11.87腫瘤直徑<45歲≥45歲<10 cm≥10 cm漿液性黏液性Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ0.5300.598 0.5530.673 0.0010.984 0.5960.553 0.5040.478 0.2390.812組織學(xué)類型1.5150.133 0.0720.788 0.3160.574 0.4230.115 0.1970.845臨床分期4.6950.001 33.6670.001 18.2420.001 0.6730.756 2.3410.021腹水6.5720.001 0.4200.517 0.1840.668 1.5870.440 3.3950.001病理分級(jí)有無G1?G2 G3 65 45 47 63 81 29 63 47 41 69 76 34 0.3170.752 20.1890.001 9.2550.002 0.1150.792 CD8+27.90±9.65 28.78±10.65 33.56±18.56 32.74±17.26 34.56±19.56 33.74±18.47 26.87±9.45 31.54±18.05 33.17±20.56 20.77±17.21 26.87±15.56 35.56±18.55 2.5480.012

2.3 VEGF、COX?2、CD4+、CD8+與TIDC 的相關(guān)性分析

VEGF、COX?2、CD8+與TIDC 均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r1=-0.654，r2=-0.584，r3=-0.524，P<0.05），CD4+與TIDC 無顯著相關(guān)性（r=-0.112，P>0.05）。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫相關(guān)，近些年腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展為臨床診治方面提供了新方向。樹突細(xì)胞在腫瘤患者中可作為一種抗原呈遞細(xì)胞，刺激細(xì)胞毒性T 細(xì)胞等的增殖，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷［9?10］。由于體外分離培養(yǎng)TIDC 較困難，因而對(duì)TIDC 的研究受到方法學(xué)的限制。本研究中采用S?100 蛋白標(biāo)記卵巢上皮性癌TIDC。大多數(shù)TIDC 體積大、樹突較長(zhǎng)，分布于腫瘤細(xì)胞之間，可通過內(nèi)胞飲、吞噬等方式攝取卵巢癌抗原［11］。Camerin等［12］研究顯示，分布在腫瘤外圍間質(zhì)的TIDC 因更靠近淋巴組織，可能處于抗原遞呈階段。本研究中，卵巢上皮性癌患者S?100 陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于健康女性，與Roze 等［13］研究報(bào)道相符。推測(cè)其原因可能是在卵巢上皮性癌抗原的刺激下，循環(huán)中的一部分DC趨化到腫瘤微環(huán)境中，參與機(jī)體免疫應(yīng)答。

VEGF 是重要的腫瘤血管生成通路，尤其是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2），在血管發(fā)生和血管生成中起重要作用。COX?2 是一種誘導(dǎo)酶，組織損傷或者患有炎癥的情況下，COX?2 表達(dá)會(huì)增強(qiáng)。COX?2 可明顯促進(jìn)VEGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（Trans?forming growth factor?beta 1，TGF?1）等前血管形成因子的生成。VEGF 可通過骨髓造血前體細(xì)胞上的受體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1（Vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1）與VEGFR2 結(jié)合，抑制造血前體細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子核因子κB 的激活，阻滯DC 前體細(xì)胞向DC 分化，誘導(dǎo)DC 細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減少DC 數(shù)量。Adler 等［14］研究證實(shí)，胃癌組織中VEGF 表達(dá)與TIDC 密度呈負(fù)相關(guān)?；谏鲜鑫墨I(xiàn)結(jié)果，本研究推測(cè)卵巢上皮性癌中VEGF、COX?2表達(dá)可能與TIDC 存在相關(guān)性，結(jié)果證實(shí)，上述因子與TIDC 呈負(fù)相關(guān)。推測(cè)可能是卵巢癌組織中高水平VEGF、COX?2 抑制了TIDC 的分化。

在控制具有免疫原性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答最為重要。T 細(xì)胞亞群主要包括CD8+、CD4+，前者可直接作為效應(yīng)細(xì)胞特異性殺傷癌細(xì)胞，后者則主要分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)腫瘤免疫。Mrch 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，卵巢上皮性癌中，CD8+、CD4+表達(dá)與正常卵巢組織比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在Ⅲ～Ⅳ期、G3中表達(dá)明顯下降。本研究與上述報(bào)道一致，表明中晚期卵巢癌中T 細(xì)胞活性功能顯著下降。進(jìn)一步分析結(jié)果提示局部組織中CD8+的分布與數(shù)量可能受TIDC 的調(diào)節(jié)。

綜上所述，卵巢上皮性癌組織中VEGF、COX?2、CD8+、CD4+均存在異常表達(dá)，且VEGF、COX?2、CD8+水平可影響卵巢上皮性癌中TIDC 的密度，可能影響宿主的抗腫瘤免疫能力與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。