p16、Ki?67檢測在宮頸上皮內(nèi)瘤變診斷及宮頸癌篩查中的價值

陳煒 周寧 廖茜 彭君臣

作者單位：1.四川綿陽四○四醫(yī)院婦科，四川，綿陽621000

2.四川綿陽四○四醫(yī)院病理科，四川，綿陽621000

上皮內(nèi)瘤樣病變（cervical intraepithelial neo?plasia，CIN）是一組與宮頸浸潤癌密切相關(guān)的癌前期病變的統(tǒng)稱，反映了宮頸癌發(fā)生中連續(xù)發(fā)展的過程［1?2］。大部分低級別CIN 可自然消退，但高級別具有癌變潛能。宮頸癌發(fā)病隱匿、疾病進展緩慢，早期無特異性臨床癥狀，為早期預(yù)防、診治帶來一定困難［3］。因此，在宮頸癌前病變階段檢出反映病變進展的標(biāo)志物，對宮頸癌的早期防治具有重要意義［4］。細(xì)胞增殖失控是發(fā)生惡性病變的重要原因，抑制基因蛋白16（Suppressor gene protein 16，p16）為細(xì)胞周期蛋白激酶的抑制因子，p16?Cy?clinD1?CDK?Rb 組成的調(diào)控途徑與宮頸腫瘤的發(fā)生有關(guān)［5］。原癌基因細(xì)胞增殖核抗原（nuclcar?as?sociated antigen，Ki?67）是一種核蛋白，在維持細(xì)胞增殖活性中具有重要作用［6］。本組研究通過檢測p16、Ki?67 在CIN 及宮頸癌中的表達，探討其在診斷CIN 及宮頸癌篩查中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2017年4月至2020年4月活檢或手術(shù)切除的子宮頸組織標(biāo)本共106 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡大于25 歲以上女性；②臨床病歷資料完整；③已婚或有過性生活；④均符合CIN 及宮頸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，且病理結(jié)果經(jīng)2 位或以上經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕婦、產(chǎn)婦及哺乳期婦女；②合并其他惡性疾病者；③術(shù)前接受放療、化療者；④標(biāo)本信息不全的標(biāo)本。

最終共納入81 例，平均年齡為（45.87±13.52）歲。其中CIN 共54 例（Ⅰ級21 例，Ⅱ級18 例，Ⅲ級15 例），宮頸癌13 例（組織學(xué)分級：Ⅰ級6 例，Ⅱ級5 例，Ⅲ級2 例），正常宮頸黏膜上皮14 例。

1.2 方法

采用S?P 免疫組化染色，標(biāo)本均用甲醛溶液浸泡，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，4.0 μm 厚度連續(xù)切片。然后根據(jù)S?P 免疫組化染色法對p16、Ki?67 進行檢測。主要試劑：鼠抗人p16 單克隆抗體、鼠抗人Ki?67 單克隆抗體，上述抗體及SP 法超敏試劑盒均由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。檢測過程嚴(yán)格按照說明進行。一抗陰性對照使用PBS（磷酸鹽緩沖液）進行代替。

染色結(jié)果判斷［8］：p16、Ki?67 陽性存在于細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)，以棕黃色顆粒為主。結(jié)果根據(jù)陽性細(xì)胞百分比、染色強度綜合判定。陽性細(xì)胞百分比：無陽性細(xì)胞0 分，陽性細(xì)胞<10% 1 分，陽性細(xì)胞10%～50%2 分，陽性細(xì)胞50%～75%3 分，陽性細(xì)胞≥75% 4 分。染色強度判定：無色0 分，淡黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分。通過上述兩項評分的乘積來綜合判定結(jié)果：0～3 分為陰性（-），4～5 分為弱陽性（+），6～7 分為中度陽性（++），8～12 分為強陽性（+++）。

1.3 觀察指標(biāo)

比較CIN、宮頸癌、正常宮頸黏膜上皮p16、Ki?67 免疫組化結(jié)果；分析p16、Ki?67 及兩者聯(lián)合檢測鑒別診斷CIN、宮頸癌、正常宮頸黏膜上皮的敏感性、特異性及準(zhǔn)確性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析；計數(shù)資料采用n（%）表示，行χ2檢驗；不同組織p16、Ki?67 表達采用秩和檢驗；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIN、宮頸癌、正常宮頸黏膜上皮中p16、Ki?67 表達情況

在不同組織類型中，p16、Ki?67 陽性表達率（P<0.05）。CIN 中，p16、Ki?67 陽性表達率隨CIN等級增加而上升（P<0.05）。見表1。

表1 CIN、宮頸癌、正常宮頸黏膜上皮中p16、Ki?67 表達情況［n（%）］Table 1 expression of p16、Ki?67 in CIN，cervical cancer and normal cervical epithelium［n（%）］

2.2 p16、Ki?67 及兩者聯(lián)合檢測鑒別診斷CIN、宮頸癌的價值

p16 鑒別診斷CIN、宮頸癌的敏感性與Ki?67 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但p16+Ki?67 聯(lián)合診斷的敏感性高于單獨的p16、Ki?67 檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.500、4.887，P=0.011、0.027）。三種檢測方法的特異性數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 p16、Ki?67 檢測鑒別診斷CIN、宮頸癌的價值［n（%）］Table 2 the value of p16，Ki?67 in differential diagnosis of CIN and cervical cancer［n（%）］

2.3 3 種檢測方法效果評價

采用ROC 曲線分析p16、Ki?67 及兩者聯(lián)合檢測對CIN、宮頸癌鑒別診斷價值，各指標(biāo)曲線下面積分別為0.751、0.675 及0.769，其中以聯(lián)合檢測的預(yù)測價值最佳。見圖1。

圖1 3 種檢測方法的ROC 曲線Figure 1 ROC curve of 3 detection methods

3 討論

宮頸癌又稱為子宮頸癌，系指發(fā)生在宮頸陰道部或移行帶的鱗狀上皮細(xì)胞及宮頸管內(nèi)膜的柱狀上皮細(xì)胞交界處的惡性腫瘤。相關(guān)研究顯示，宮頸癌主要是由高危型HPV 導(dǎo)致宮頸鱗狀上皮發(fā)生異型增生引起，由CIN 等癌前病變長期發(fā)展形成，但并非所有的CIN 都會發(fā)展為癌，且CIN 發(fā)展為癌的過程較長［9。因此，正確預(yù)測CIN 的發(fā)展，對宮頸癌早期防治和預(yù)防CIN 患者過度治療具有重要意義。

p16 是在人染色體9p21 中發(fā)現(xiàn)的一個直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的抑癌基因。對于正常細(xì)胞的HPV 一過性感染，檢測不到p16 表達；而在HPV 轉(zhuǎn)化性感染后，可使抑癌基因失活，致癌基因E6和E7過表達，細(xì)胞無限制增殖，引起p16 的過度表達，并被免疫組化檢測到［10］。Ciesielska 等［11］報道指出，CIN 和宮頸癌中網(wǎng)膜母細(xì)胞基因的失活會導(dǎo)致p16 表達升高。本組研究結(jié)果提示p16 高表達參與宮頸上皮內(nèi)瘤變到癌的演進過程，故連續(xù)監(jiān)測p16 表達可有效反映宮頸黏膜病變進展情況。

Ki?67 的表達出現(xiàn)于除G0和G1早期之外的細(xì)胞周期中，細(xì)胞有絲分裂后其蛋白含量迅速減少，是全面反映細(xì)胞群增殖活性的可靠指標(biāo)［12］。高度增生的細(xì)胞多與癌前病變組織及惡性組織相關(guān)，增生常被認(rèn)為是生長紊亂的早期指標(biāo)［13］。Ki?67 是目前已知的增殖抗原中最具增殖能力代表性，且應(yīng)用廣泛的細(xì)胞增殖標(biāo)記之一［14］。本組研究中，Ki?67陽性表達率隨宮頸病變嚴(yán)重程度加重而增高，提示在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞增殖活性也逐漸增強。因此Ki?67 可作為預(yù)測CIN 和宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要標(biāo)記物。

Ovestad I 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，增加p16 免疫組化染色結(jié)合HE 切片，可提高高級別CIN 的診斷準(zhǔn)確性、敏感性。病理學(xué)專家在診斷高級別CIN 中，發(fā)現(xiàn)p16 染色表現(xiàn)的重復(fù)性極好，可明顯改善宮頸組織病理的常規(guī)診斷［16］。本組研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)p16+Ki?67聯(lián)合診斷的敏感性高于單獨的p16、Ki?67 檢測。由此可見單一的p16 用于診斷宮頸病變誤診率較小，但存在一定漏診率，因此認(rèn)為p16 染色不適用于早期發(fā)現(xiàn)宮頸病變。而單一的Ki?67 在診斷宮頸病變上漏診率較小，但誤診率高，而聯(lián)合兩種標(biāo)記物能有效提高診斷的可靠性。

綜上所述，p16、Ki?67 陽性表達率隨宮頸病變嚴(yán)重程度加重而增高，兩者聯(lián)合檢測可有效區(qū)分不同等級CIN 及宮頸癌，可作為宮頸癌前病變進展的一個敏感標(biāo)志物，能準(zhǔn)確識別高級別CIN 病變并及時治療，阻斷宮頸癌變進程，為臨床早期預(yù)防、診治宮頸癌前病變及宮頸癌提供了可靠的理論依據(jù)。