EMT標(biāo)志物在胎膜早破患者羊膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)及意義

陳靜寧 許靜蕓 羅曉薇 張?jiān)?吳盛桂 宮國(guó)良★

作者單位：1.汕頭市金平區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，廣東，汕頭515044

2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，廣東，汕頭515044

3.汕頭潮南民生醫(yī)院病理科，廣東，汕頭515044

胎膜早破（Premature rupture of membranes，PROM）是最常見(jiàn)的產(chǎn)科疾病之一，臨床上分為早產(chǎn)PROM（preterm premature rupture of membranes，PPROM）和足月PROM（Term premature rupture of membranes，TPROM）。PROM 是早產(chǎn)的主要原因，會(huì)引起各種并發(fā)癥，其中不乏胎兒死亡等嚴(yán)重情況［1?2］。對(duì)PROM 的機(jī)制研究，一直是臨床熱點(diǎn)，盡管已經(jīng)提出了各種潛在的機(jī)制，但其確切的機(jī)制尚不清楚，最新的研究表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithe?lial?mesenchymal transition，EMT）在胎膜早破的發(fā)生中有密切聯(lián)系，EMT 參與了PROM，并且發(fā)揮了重要作用［3?4］。在以往的研究中，大多選用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或者蛋白質(zhì)印跡等方法檢測(cè)胎膜中EMT的標(biāo)志物的表達(dá)情況［5］，而對(duì)于胎盤(pán)羊膜上皮細(xì)胞中EMT 的標(biāo)志物的免疫組化檢測(cè)研究且較少，本文將探討EMT 標(biāo)志物在PROM 中的表達(dá)情況，闡述EMT 在胎膜早破中的作用機(jī)制，旨在為PROM的預(yù)測(cè)、診斷及治療及提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 一般材料

選取本院2017年1月1日至2020年12月31日產(chǎn)科因PROM 而住院的患者，經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)共收集PROM 患者胎盤(pán)221 例，其中TPROM 143 例，年齡（25.97±4.48）歲，孕周（39.13±1.32）周；PPROM 78 例，年齡（26.87±5.52）歲，孕周（33.31±2.53）周；并收集同一時(shí)間段正常產(chǎn)胎盤(pán)51 例作為對(duì)照組，年齡（26.12±5.03）歲，孕周（39.31±1.41）周。所有患者均同意將胎盤(pán)送至病理科檢查及參與科學(xué)研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：PROM 納入標(biāo)準(zhǔn)包括診斷為PROM，且妊娠大于26 周的患者，并有完整的病例信息記錄。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除多胎妊娠、畸形、試管嬰兒及妊娠期常見(jiàn)疾病，如妊娠期糖尿病和先兆子癇，以及明確的產(chǎn)婦及胎兒感染。

1.2 方法

1.2.1 患者的基本臨床信息

收集的病例均以胎膜早破為第一診斷入院，采集的臨床數(shù)據(jù)均為入院后第一次記錄或檢查結(jié)果，包括產(chǎn)婦年齡、孕產(chǎn)次、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白濃度、凝血酶原時(shí)間、總蛋白量、白蛋白量、球蛋白量、白/球比例信息。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色及評(píng)估

標(biāo)本經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片及染色。E?Cadherin 單克隆抗體（克隆號(hào)：MX020，稀釋度1∶100）、Vimentin 單克隆抗體（克隆號(hào)：MX034，稀釋度1∶100）均購(gòu)自中國(guó)福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；MMP9 單克隆抗體（克隆號(hào)：56?2A4，稀釋度1∶300）、TIMP1 單克隆抗體（克隆號(hào)：EPR18352，稀釋度1∶300）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。免疫組織化學(xué)采用深圳達(dá)盟生物科技有限公司全自動(dòng)免疫組化染色系統(tǒng)，機(jī)器型號(hào)為AS300。由胎膜破裂位置開(kāi)始在歐林巴斯B51 顯微鏡下觀察，由兩位病理醫(yī)生進(jìn)行免疫組化評(píng)分。參考免疫反應(yīng)評(píng)分（IRS）［6］，結(jié)果以染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分比表示，在染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比的基礎(chǔ)上進(jìn)行評(píng)估免疫組化指標(biāo)。其中E?Cadherin、MMP9、TIMP1 基本所用的病例均出現(xiàn)不同程度的陽(yáng)性表達(dá)，因此分類(lèi)上采用強(qiáng)表達(dá)和弱表達(dá)來(lái)表示，Vimentin 出現(xiàn)部分陰性表達(dá)病例，采用強(qiáng)表達(dá)、弱表達(dá)、陰性三分類(lèi)。由于部分病例出現(xiàn)羊膜上皮細(xì)胞脫落，因此，免疫組化只染色能夠完整顯示羊膜上皮細(xì)胞的病例。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，多組事后兩兩比較使用FDR 校正P值；計(jì)量資料以（）表示；使用Shap?iro?Wilk 檢驗(yàn)是否服從正態(tài)分布；服從正態(tài)分布的，使用Levene 檢驗(yàn)是否方差相等。方差相等的，使用方差分析。當(dāng)方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的，使用SNK 檢驗(yàn)事后兩兩比較；方差不相等的，或不服從正態(tài)分布的，使用Kruskal?Wallis 檢驗(yàn)。當(dāng)Kruskal?Wallis 檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的，使用Nemenyi 檢驗(yàn)進(jìn)行事后兩兩比較。E?cadherin、vimentin、MMP9、TIMP1 組間比較采用方差分析；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組基本資料比較

在孕、產(chǎn)次上比較，對(duì)照組>PPROM 組>TPROM 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。3 組間年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白值、血小板計(jì)數(shù)、凝血酶時(shí)間、白蛋白、球蛋白指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 胎膜早破組與對(duì)照組基本資料比較［M（Q1?Q3），（±s）］Table 1 Comparison of basic data between premature rupture of membranes group and control group［M（Q1?Q3），（±s）］

表1 胎膜早破組與對(duì)照組基本資料比較［M（Q1?Q3），（±s）］Table 1 Comparison of basic data between premature rupture of membranes group and control group［M（Q1?Q3），（±s）］

注：組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，aP<0.05；b 為方差分析得到P 值，其他均為Kruskal?Wallis 檢驗(yàn)得到P 值。

項(xiàng)目年齡白細(xì)胞中性粒單核細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白血小板凝血酶原時(shí)間總蛋白白蛋白球蛋白白球比例孕次產(chǎn)次n n n 51 51 51 51 51 51 51 50 51 51 51 51 51 51足月對(duì)照26.00（22.00～30.00）10.08（8.31～12.63）6.98（5.71～9.43）0.64（0.54～0.86）4.03（3.68～4.16）112.76±16.21 212.00（178.50～250.50）9.50（9.12～9.80）62.80（59.85～66.20）33.20（31.65～35.10）29.60（28.00～31.25）1.12（1.06～1.23）2.00（1.00～3.00）2.00（1.00～2.00）78 78 78 78 78 78 78 71 73 73 73 73 78 78 PPROM 組26.00（23.25～30.00）10.55（9.28～13.73）7.33（6.04～9.96）0.78（0.62～0.99）3.79（3.56～4.08）109.85±12.44 218.50（194.00～256.75）9.70（9.38～10.12）61.60（58.90～65.30）33.40（31.40～35.40）28.10（26.00～30.40）1.17（1.05～1.34）2.00（1.00～2.00）2.00（1.00～2.00）143 143 143 143 143 143 143 130 143 143 143 142 143 143 TPROM 組26.00（23.00～28.00）10.54（8.91～12.70）7.00（5.90～9.26）0.70（0.52～0.90）3.88（3.61～4.12）109.10±16.38 230.50（172.50～271.75）9.60（9.20～10.00）61.95（59.60～64.40）33.10（31.50～34.70）29.40（26.60～31.08）1.14（1.04～1.29）1.00（1.00～2.00）1.00（1.00～2.00）統(tǒng)計(jì)量1.319 2.515 1.674 7.068 5.429 1.075 1.676 3.360 1.793 0.959 3.909 3.069 8.896 13.482 P 值0.517 0.284 0.433 0.029 0.066 0.343b 0.433 0.186 0.408 0.619 0.142 0.216 0.012 0.001

2.2 EMT 標(biāo)志物在胎膜早破患者胎盤(pán)羊膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)

E?cadherin 在各組中均出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，并且以強(qiáng)陽(yáng)性為主，各組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Vimentin 在3 組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MMP9 和TIMP1 在各組間表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

表2 EMT 標(biāo)志物在胎盤(pán)羊膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況［n（%）］Table 2 Expression of EMT markers in placental amniotic epithelial cells［n（%）］

圖1 Vimentin、MMP9、TIMP1 在胎膜早破患者胎盤(pán)羊膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)（SP，×400）Figure 1 Expression of Vimentin，MMP9 and TIMP1 in placental amniotic epithelial cells of patients with premature rupture of membranes（SP，×400）

3 討論

羊膜表面為上皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞下為致密的胚外中胚層，含較多的肌纖維母細(xì)胞。肌纖維母細(xì)胞能夠產(chǎn)生膠原纖維，因此保持足夠數(shù)量的肌纖維母細(xì)胞是保障羊膜強(qiáng)度的關(guān)鍵因素。目前的研究認(rèn)為，肌纖維母細(xì)胞的來(lái)源有以下幾種方式：間質(zhì)固有肌纖維母細(xì)胞活化；循環(huán)中來(lái)源于骨髓的纖維母細(xì)胞遷入；除了這兩種主要來(lái)源外，上皮細(xì)胞可以通過(guò)EMT 轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞，參與組織纖維化修復(fù)以補(bǔ)充肌纖維母細(xì)胞的數(shù)量，來(lái)維持生理功能的穩(wěn)定，EMT 是指上皮細(xì)胞在特定的條件下發(fā)生程序性轉(zhuǎn)化，經(jīng)過(guò)細(xì)胞骨架重塑，轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間葉細(xì)胞的過(guò)程。EMT 不僅存在胚胎發(fā)育過(guò)程中，同時(shí)還參與了組織再生、器官纖維化以及腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等過(guò)程，從組織的修復(fù)理論上來(lái)說(shuō)，EMT 參與胎膜早破的過(guò)程也是合理的［7］。

大部分理論認(rèn)為，PROM 由多個(gè)因素引起，炎癥、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等均參與其中［8?9］，而EMT 與PROM 的關(guān)系研究是近幾年才出現(xiàn)的，理論體系尚不十分完整。對(duì)于EMT 的研究，首先是選取標(biāo)志物，不同研究文獻(xiàn)中選用的標(biāo)志物大同小異［10］，本研究選用比較常見(jiàn)的、意義明確的EMT 標(biāo)志物，分別為：E?cad?herin、Vimentin、MMP9、TIMP1。E?Cadherin 是主要的EMT 標(biāo)志物，其減少或丟失是EMT 的標(biāo)志性改變。有關(guān)EMT 和PROM 的研究文獻(xiàn)中，大多數(shù)都會(huì)選取該指標(biāo)，但研究方法很少采用免疫組化法，本研究結(jié)果這體現(xiàn)出免疫組化的弊端，免疫組化是最好的定性指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于臨床和科研中，但其沒(méi)有精確定量的功能。因此，在免疫組化水平，E?Cadherin 無(wú)法應(yīng)用于EMT 與PROM 關(guān)系研究。研究中Vimentin，MMP9，TIMP1 均出現(xiàn)差異性表達(dá)，針對(duì)于胎膜早破的EMT 機(jī)制研究，這3 個(gè)指標(biāo)在免疫組化水平可以應(yīng)用。Vimentin、MMP9、TIMP1 均為常用的EMT 標(biāo)志物，其中以Vimentin意義最為突出，Vimentin 是最典型的間葉細(xì)胞標(biāo)志物，Vimentin 在羊膜上皮細(xì)胞中出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，代表著羊膜上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化這一EMT 過(guò)程。MMP9 和TIMP1 在各組間表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究和文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［11?12］。

有關(guān)PROM 與EMT 的研究并不多，最有代表性的是Haruta Mogami 分別于2017年和2018年在同一期刊發(fā)表的兩篇論著［3?4］，對(duì)EMT 在胎膜早破中的作用進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)，小破裂引起細(xì)胞因子的瞬時(shí)上調(diào)，而大破裂引起胎膜中促炎細(xì)胞因子的持續(xù)上調(diào)。來(lái)自羊膜的胎兒巨噬細(xì)胞被募集到破裂的羊膜中，其中巨噬細(xì)胞粘附分子被高度表達(dá)。招募的巨噬細(xì)胞釋放IL?1β 和TNF，促進(jìn)EMT 和上皮細(xì)胞遷移。該研究為EMT 在PROM 中的作用機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。Carla Janzen 于2017年發(fā)表了題目為《The Role of Epithelial to Mesenchymal Tran?sition in Human Amniotic Membrane Rupture》的論著［5］，通過(guò)對(duì)人類(lèi)胎膜和羊膜上皮細(xì)胞的研究，提出在PPROM 的羊膜中，EMT 作用增強(qiáng)，研究從免疫組化角度證實(shí)了這一理論。希望通過(guò)新的理論，能夠提出針對(duì)EMT 的治療手段，達(dá)到預(yù)防和治療胎膜早破這一產(chǎn)科常見(jiàn)疾病的目的。

綜上所述，EMT 參與了PROM 的發(fā)病過(guò)程，免疫組化方法檢測(cè)vimentin、MMP9、TIMP1 在羊膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)可以作為其發(fā)生EMT 標(biāo)志物，在臨床工作中，通過(guò)干預(yù)EMT 這一病理過(guò)程，有望成為治療胎膜早破的一個(gè)新思路。