藥用植物滇黃精寄生真菌的分離與鑒定

譚 偉，浦仕彪

（云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650500）

0 引言

滇黃精(Polygonatum kingianum)為百合科黃精屬多年草本植物[1]。據(jù)《中國藥典》2015版記載，黃精為百合科植物滇黃精(Polygonatum kingianum)、黃精(Polygonatum sibiricum)或多花黃精(Polygonatum cyrtonema)的干燥根莖，滇黃精是中藥黃精3種基源植物之一[2]?！吨袊参镏尽酚涊d，滇黃精主要分布于中國西南地區(qū)，主產(chǎn)于云南，具有悠久的用藥歷史[3-4]。現(xiàn)代研究確定滇黃精中含有多糖、甾體皂苷、黃酮、蒽醌類化合物等多種化學(xué)成分，具有降血糖、降血脂、抗衰老、提高免疫力、抗炎、抗腫瘤等多種作用[5-8]，因此具有較高的藥用價值和保健功效。隨著以黃精為主要原料的各類保健酒、飲料、化妝品等養(yǎng)生保健品[9-10]市場需求的不斷擴(kuò)大，黃精的資源壓力巨大。滇黃精已在云南多地進(jìn)行人工栽培，隨著種植面積不斷擴(kuò)大，其病害也日益嚴(yán)重。陳澤歷等[11]研究認(rèn)為大面積單一種植滇黃精會導(dǎo)致病害發(fā)生變得嚴(yán)重。云南多地為了提高滇黃精的種植效益，對滇黃精的栽培技術(shù)進(jìn)行了研究。尤俊榮等[12]探索云南松林下滇黃精的栽培技術(shù)，刀立華等[13]在云南普洱市景谷鎮(zhèn)探索山地茶園套種滇黃精。王橋美等[14]發(fā)現(xiàn)滇黃精病害主要有黑斑病、葉斑病、軟腐病、炭疽病、根腐病等，其病害多為真菌侵染性病害。田啟建等[15]發(fā)現(xiàn)貴州黃精的主要病害種類為黑斑病、葉斑病和炭疽病，它們的病原均為半知菌亞門真菌。嚴(yán)吉明等[16]對四川省54種藥用植物進(jìn)行病原鑒定，鑒定出病害115種，其中大部分為真菌侵染性病害。黃劍等[17]對貴州省53種藥用植物進(jìn)行病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)真菌性病害為38種。藥用植物主要病害為真菌侵染性病害。該種病原真菌寄生于活體植物，并從宿主攝取營養(yǎng)，在其體內(nèi)生長繁殖，對宿主產(chǎn)生極大危害，產(chǎn)生一系列病理性癥狀。許多植物體內(nèi)除了含有致病性真菌外，還有對植物體有益的內(nèi)生真菌[18]，它是某一段時期生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的一類真菌。植物與內(nèi)生真菌互利共生，內(nèi)生真菌能增強(qiáng)植物抗病害能力，它分泌的代謝產(chǎn)物能促進(jìn)植物生長，內(nèi)生真菌已廣泛應(yīng)用于生物制藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[19]。筆者對滇黃精寄生真菌進(jìn)行分離與鑒定，以期為其病害防治提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集麗江華坪縣、麗江玉龍縣魯?shù)猷l(xiāng)的滇黃精全株各12株。

1.2 方法

1.2.1 真菌的分離與鑒定

（1）樣品保濕培養(yǎng)。將進(jìn)行過表面處理的滇黃精樣品按部位切割成大小合適的小樣品，置于事先用酒精擦拭過且晾干的保鮮盒中，在盒子的對角處放置大小合適的棉花，并向棉花中滴灑無菌水，直到浸透棉花且不溢出，蓋上保鮮盒蓋子，時常不斷觀察直至樣品表面長出真菌。

（2）分離和純化。對長出真菌的樣品，于超凈工作臺上用滅菌接種針挑取少量的菌絲并接種于PDA培養(yǎng)基中，均勻地在培養(yǎng)基上點(diǎn)3個點(diǎn)，并做好標(biāo)記。此過程可根據(jù)樣品上有幾種不同顏色、形態(tài)等明顯區(qū)分的菌落，挑取對應(yīng)的皿數(shù)。待真菌長出后觀察同一皿中顏色、形狀等是否有差距，如果有進(jìn)行下一輪純化，直至長出的真菌沒有污染，屬于同一種菌即可。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 觀察并記錄PDA培養(yǎng)基中菌落的直徑、顏色、形態(tài)的變化及生長速度。DNA提取前，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄菌絲及孢子形態(tài)特征[20-21]。參考《真菌鑒定手冊》[22]、《中國真菌志》[23]等，初步鑒定寄生真菌。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 采用CTBA法[24-29]提取真菌基因組DNA。ITS擴(kuò)增使用的引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3')，兩者為通用引物，由昆明擎科生物有限公司合成。50 μL PCR反應(yīng)體系為10 μL 10×PCR Buffer、0.25 μL dNTPs(10 mmol/L)、1 μL ITS4、1 μL ITS5、0.3 μLTaq酶、1 μLDNA模板，用ddH2O補(bǔ)足50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 4 min，94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃1 min，33個循環(huán)，72℃ 3 min，4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物由昆明擎科生物有限公司測序。測序結(jié)果通過Chromas軟件校對，以每個形態(tài)型菌株的ITS序列作為靶序列，在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中通過Blast搜索，將相似度最高的序列作為參考序列。確定序列的有效性；打開序列文件并復(fù)制該序列；打開NCBI網(wǎng)站，進(jìn)入BLAST功能區(qū)域選擇Nucleotide BLAST；粘貼序列于序列框，輸入序列編號，勾選“show results in a window”；點(diǎn)擊BLAST；根據(jù)ident（百分比）確定所測樣品序列的分類地位。RensKe Landeweer等[30]認(rèn)為通過ITS區(qū)域比對，序列相似性大于99%，鑒別為相同種；序列相似性大于95%且小于99%，鑒別為相同屬；序列相似性小于95%，鑒別為相同科。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定

采于玉龍縣魯?shù)猷l(xiāng)的滇黃精分離培養(yǎng)得到15皿寄生真菌菌落，采于華坪縣的滇黃精分離得到22皿寄生真菌菌落。同時，對兩地滇黃精寄生真菌菌落進(jìn)行觀察和具體形態(tài)特征的統(tǒng)計(jì)分析（圖1～2、表1～2）。

表1 玉龍縣魯?shù)猷l(xiāng)黃精寄生真菌菌落統(tǒng)計(jì)及具體形態(tài)特征

表2 華坪縣黃精寄生真菌菌落統(tǒng)計(jì)及具體形態(tài)特征

圖1 玉龍縣魯?shù)猷l(xiāng)滇黃精寄生真菌菌落形態(tài)

圖2 華坪縣滇黃精寄生真菌菌落形態(tài)圖

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

序列比對結(jié)果顯示，玉龍縣魯?shù)猷l(xiāng)15株寄生真菌菌落中包括1株青霉屬、12株尖孢鐮刀菌、1株木賊鐮刀菌、1株鏈格孢菌，鐮刀菌（木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌）占總菌落的86.66%，可初步認(rèn)定其為優(yōu)勢寄生種。華坪縣22株滇黃精寄生真菌菌落中包括12株黑綠木霉、9株芬芳鐮刀菌、1株木賊鐮刀菌，黑綠木霉占總菌落的54.5%，可初步認(rèn)定其為優(yōu)勢寄生種（表3～4）。

表3 玉龍縣魯?shù)猷l(xiāng)滇黃精寄生真菌DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果

表4 華坪縣滇黃精寄生真菌DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果

3 討論

由麗江華坪縣和玉龍縣魯?shù)猷l(xiāng)兩地滇黃精寄生真菌分離與鑒定結(jié)果可知，鐮刀菌屬真菌是滇黃精主要的致病真菌，其次是木霉屬真菌，試驗(yàn)中木霉菌屬只發(fā)生于華坪縣滇黃精中。鐮刀菌屬擁有多種致病菌，具有致病范圍廣和治病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，可引起植物的萎蔫、穗腐和根腐等多種病癥，如小麥赤霉病、香蕉枯萎病和棉花枯萎病，已成為世界上重要的致病真菌之一[30]。因此兩地在進(jìn)行滇黃精種植病害防治時，應(yīng)以鐮刀菌屬真菌為主要防治對象，合理采取防治措施。

滇黃精作為藥食兩用的傳統(tǒng)中藥資源，具有較大的市場需求。已有文獻(xiàn)中關(guān)于滇黃精病害的研究報(bào)道較少，其中王橋美等[14]認(rèn)為滇黃精主要病害有葉斑病、黑斑病、炭疽病，葉斑病和黑斑病的致病真菌主要為鏈格孢屬(Alternaria)。楊林毅[31]對采于云南曲靖的滇黃精進(jìn)行病原真菌的分離鑒定，得到主要致病真菌為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)。筆者從麗江滇黃精中分離鑒定得到鐮刀菌屬真菌，其中采于玉龍縣魯?shù)猷l(xiāng)的滇黃精還分離得到鏈格孢屬真菌，與2篇報(bào)道有共性之處。但鐮刀菌屬真菌是滇黃精普遍的致病真菌仍需要進(jìn)一步研究。各地在滇黃精病害防治時，應(yīng)該因地制宜，采取科學(xué)有效的方法進(jìn)行病害防治。