拮抗芽孢桿菌對(duì)蒙古黃芪主要藥效成分的影響

郭 捷，田海嬌，秦雪梅，趙曉霞，高 芬

（1山西省科技資源與大型儀器開放共享中心，太原 030006；2山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原 030006；3山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，太原 030006）

0 引言

黃芪為豆科植物蒙古黃芪(Astragalus membranaceus var.mongholicus)或膜莢黃芪(Astagalus membranaceus)的干燥根，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等功效。在臨床上應(yīng)用廣泛，具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗炎、抗氧化、抗病毒等多種藥理作用[1]，其主要活性成分包括黃酮類化合物、皂苷類化合物、黃芪多糖等[2]。但是，隨著黃芪用量的急劇增長(zhǎng)，多年生傳統(tǒng)黃芪（野生）遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求，并急劇減少，幾乎絕跡。隨著中藥現(xiàn)代化的發(fā)展，20世紀(jì)70—80年代育苗移栽2年生蒙古黃芪的栽培技術(shù)在甘肅、內(nèi)蒙、山西等地獲得成功[3]。2012年黃芪納入藥食同源目錄，年需求量達(dá)3.5萬(wàn)～4萬(wàn)t，其中90%以上為移栽黃芪，且主要是蒙古黃芪[4]。山西作為蒙古黃芪的主產(chǎn)區(qū)，移栽芪的種植面積日趨擴(kuò)大，但隨之而來(lái)被稱為“植物癌癥”的根腐病發(fā)生逐年加重[5-6]，給黃芪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了明顯影響。

同時(shí)，研究人員還發(fā)現(xiàn)移栽芪中某些藥效成分明顯低于（仿）野生芪。如杜國(guó)軍等[3]報(bào)道傳統(tǒng)黃芪的毛蕊異黃酮葡萄糖苷和總多糖含量明顯高于2年生移栽黃芪；劉鳳波等[7]發(fā)現(xiàn)野生黃芪總皂苷的含量較栽培黃芪高；熊一峰等[8]比較了山西2種種植方式黃芪的次級(jí)代謝產(chǎn)物的差異后，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)芪中黃芪皂苷Ⅲ的含量顯著高于移栽芪，移栽芪中的黃芪皂苷Ⅰ顯著高于傳統(tǒng)芪，但4種皂苷含量的總和無(wú)顯著差異；Li等[9]發(fā)現(xiàn)野生黃芪中多糖和糖綴合物等糖類組分的含量普遍高于速生黃芪。藥材中的化學(xué)成分是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，藥效成分的穩(wěn)定性和均一性是確保中藥材質(zhì)量及中醫(yī)臨床用藥安全有效的關(guān)鍵[10]。因此，移栽芪藥效成分含量變化導(dǎo)致的藥材質(zhì)量不穩(wěn)定及質(zhì)量下降問(wèn)題也成為了困擾黃芪栽培發(fā)展的瓶頸。

利用有益拮抗微生物進(jìn)行病害生物防治是目前的研究熱點(diǎn)，其中芽孢桿菌以抗逆性強(qiáng)、易于在植物根際定殖、對(duì)病原菌具有拮抗作用等優(yōu)勢(shì)，對(duì)多種作物的土傳病害顯示出了良好的防治效果[11-13]，同時(shí)還可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量[14-15]。不僅如此，芽孢桿菌在調(diào)節(jié)植物營(yíng)養(yǎng)成分、改善品質(zhì)方面也顯示出了潛力。如吳東升[16]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌T3可提高西瓜中可溶性糖的含量，改善其風(fēng)味和品質(zhì)。鞏子毓等[17]在設(shè)施黃瓜的種植中施用含解淀粉芽孢桿菌SQR9的生物有機(jī)肥，明顯提高了黃瓜中維生素C、可溶性糖、可溶性蛋白的含量。劉德興等[18]也發(fā)現(xiàn)多粘性芽孢桿菌生物菌肥處理在提高甜瓜單果重的同時(shí)，促進(jìn)了可溶性糖和維生素C含量的升高。

芽孢桿菌對(duì)中藥材藥效成分也有影響。Karthikeyan等[19]報(bào)道，固氮菌、芽孢桿菌和假單胞菌等根際促生細(xì)菌共同作用可以提高長(zhǎng)春花抗癌有效成分生物堿的含量。Sharaf-Eldin等[20]報(bào)道枯草芽孢桿菌FZB24可以提高藏紅花中番紅花苦苷、番紅花酸和藏紅花醛的含量。宋勝男等[21]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生多黏類芽孢桿菌對(duì)農(nóng)田人參生長(zhǎng)和皂苷累積起著促進(jìn)作用。馮世鑫等[22]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌肥施用后羅漢果中的主效成分皂苷Ⅴ含量明顯升高。目前，雖未見(jiàn)芽孢桿菌對(duì)蒙古黃芪有效成分影響的相關(guān)報(bào)道，但有研究發(fā)現(xiàn)，非生物誘導(dǎo)子水楊酸(SA)、萘乙酸(SNP)和硝普鈉(NAA)可分別有效提高其黃酮、皂苷及多糖的含量[23]。

鑒于黃芪作為藥用植物在生產(chǎn)和用途上的特殊性，在病害防治中使用的制劑既要能有效防治病害，又不能影響藥材的品質(zhì)。菌株SXKF16-1(Bacillus atrophaeu)[24]和 SXKF16-2(B.methylotrophicus)是本課題組前期以根腐病致病菌腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)和銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)為靶標(biāo)篩選獲得的2株拮抗芽孢桿菌，其發(fā)酵液對(duì)黃芪根腐病具有較好的預(yù)防和治療效果。但是，上述菌株的發(fā)酵液施用后對(duì)黃芪藥效成分的影響，以及能否提升某些藥效成分的含量等問(wèn)題還不明確。本研究采用課題組前期建立的HPLC-UV-ELSD法，測(cè)定并分析上述2株拮抗芽孢桿菌發(fā)酵液施用后，蒙古黃芪10種主要藥效成分（黃酮類包括毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、異黃烷苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素；皂苷類包括黃芪皂苷IV、黃芪皂苷III、黃芪皂苷II和黃芪皂苷I）的含量變化，以明確其對(duì)黃芪藥效成分的影響，進(jìn)而尋找藥效成分的促進(jìn)因子，旨在為開發(fā)具有抗病增效作用的多功能制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

蒙古黃芪（以下簡(jiǎn)稱黃芪）生長(zhǎng)6個(gè)月的新鮮健康黃芪（根長(zhǎng)15 cm左右，直徑3～4 mm），采自山西寧武黃芪種植基地。黃芪品種由山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅鑒定。

拮抗菌為菌株SXKF16-1(Bacillus atrophaeus)、菌株SXKF16-2(B.methylotrophicus)，由本課題組前期篩選獲得并保存。

1.2 儀器與試劑

Waters e2695液相色譜儀、Waters 2489紫外可見(jiàn)檢測(cè)器、Chromachem ELSD檢測(cè)器、Empower色譜工作站；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Sartorius BSA124S分析天平。

乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司）。

對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷(CAS No.20633-67-4)、芒柄花素(CAS No.485-72-3)、黃芪皂苷 I(CAS No.84680-75-1)、黃芪皂苷 II(CAS No.84676-89-1)、黃芪皂苷III(CAS No.84687-42-3)、黃芪皂苷IV(CAS No.84687-43-4)、紫檀烷苷(CAS No.94367-42-7)和異黃烷苷(CAS No.94367-43-8)均購(gòu)于上海永恒生物科技有限公司；芒柄花苷(CAS No.486-62-4)、毛蕊異黃酮(CAS No.20575-57-9)購(gòu)于成都曼斯特公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 拮抗菌發(fā)酵液的制備與澆注 分別將拮抗芽孢桿菌SXKF16-1、SXKF16-2在PDA培養(yǎng)基上活化48 h(28℃)，配制成濃度為1.5×107～2.0×108cfu/mL的菌懸液，按體積比4%的比例接種到50 mL（250 mL三角瓶）的專用發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床恒溫振蕩培養(yǎng)48 h(180 r/min，30℃)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)拮抗菌數(shù)量后，用于黃芪苗的澆注。黃芪幼苗移栽40天后澆注拮抗菌發(fā)酵液；每盆300 mL，澆注3次，每次間隔10天；第3次澆注后20天采集樣本并置于液氮速凍15 min后，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?duì)照組黃芪澆注相同體積的水?；ㄅ鑳?nèi)徑17 cm、高15 cm，齊沿將土裝滿；每處理3次重復(fù)（3盆），每盆15株；從每重復(fù)中隨機(jī)采樣5株，共計(jì)15株進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 供試品溶液的制備 將各處理黃芪樣品晾干，用研缽研磨后過(guò)篩；精確稱取黃芪粉末1.5 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入60 mL甲醇加熱回流3 h后過(guò)濾；濾渣用20 mL甲醇沖洗3次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)至干；用色譜純甲醇溶解試樣，超聲2～3 min使其充分溶解后，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中定容[3]；用0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 色譜條件 按照課題組前期已建立的方法[8]進(jìn)行測(cè)定。流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，體積流量為1.0 mL/min；蒸發(fā)光檢測(cè)器參數(shù)N2壓力158.5 MPa，霧化溫度35℃，汽化溫度50℃，增益值5.0；Venusil MP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量20 μL。梯度洗脫：0～8 min，20%A；8～15 min，30%A；15～30 min，30%～43%A；30～40 min，43%～60%A；40～60 min，60%～100%A；60～65 min，100%～20%A。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精確稱取對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、異黃烷苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素和黃芪皂苷Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、I于10 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，配制成濃度為1.870、1.360、1.362、0.601、0.552、1.254、0.979、0.500、0.582、1.972 mg/mL的貯備液。貯備液分別逐級(jí)稀釋，配制成系列濃度并經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣20 μL測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6種黃酮類成分，以橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量（濃度）(X)、縱坐標(biāo)為峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸；4種皂苷成分，以進(jìn)樣量（濃度）的對(duì)數(shù)(x)為橫坐標(biāo)、峰面積的對(duì)數(shù)(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸；回歸方程及其線性范圍見(jiàn)表1，對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 黃芪10種藥效成分的回歸方程

1.3.5 樣品測(cè)定 取各組次樣品按1.3.2處理后測(cè)定。黃酮類成分對(duì)照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣20 μL；皂苷類成分對(duì)照品溶液、供試品溶液分別進(jìn)樣10、20 μL。記錄色譜峰的峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算各成分的含量。樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2016處理數(shù)據(jù)，SPSS 16.0進(jìn)行方差分析。各處理間每個(gè)組分的顯著性差異比較采用Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-UV-ELSD測(cè)定結(jié)果

圖1 中不同處理的10種成分在2種檢測(cè)器中得到了良好的響應(yīng)，且出峰時(shí)間基本一致。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、異黃烷苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅳ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪皂苷Ⅰ的保留時(shí)間分別為9.789、19.398、21.14、21.917、24.298、35.014、25.455、26.03、31.096、38.713 min，各色譜峰的峰形良好，與前后峰的分離度符合要求，基線也較為平坦，能夠滿足不同成分含量變化測(cè)定的要求。測(cè)定完成后，將6種黃酮的含量相加得到總黃酮的含量，4種皂苷的含量相加得到總皂苷含量。

圖1 黃芪10種藥效成分的HPLC圖譜

2.2 芽孢桿菌對(duì)黃芪藥效成分的影響

與對(duì)照組相比，黃芪幼苗澆注芽孢桿菌SXKF16-1和SXKF16-2的發(fā)酵液后，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、異黃烷苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅳ的含量均無(wú)明顯變化，而黃芪皂苷Ⅰ和黃芪皂苷Ⅲ的含量在2株菌發(fā)酵液澆注處理后均顯著升高（表2）。同時(shí)，SXKF16-1和SXKF16-2處理間對(duì)毛蕊異黃酮和芒柄花素的影響存在差異，前者的處理組中這2種成分的含量均顯著高于后者。從總黃酮和總皂苷含量的變化看，2株拮抗芽孢桿菌處理后總黃酮含量與對(duì)照組差別不明顯，總皂苷的含量相較于對(duì)照組明顯升高（圖2）。

表2 芽孢桿菌處理組與對(duì)照組黃芪中10種成分的含量比較 mg/g

圖2 芽孢桿菌處理組與對(duì)照組黃芪總黃酮和總皂苷含量比較

3 討論

研究結(jié)果表明，拮抗芽孢桿菌SXKF16-1和SXKF16-2的發(fā)酵液澆注黃芪幼苗后，其根內(nèi)總黃酮成分含量都沒(méi)有明顯變化，但是總皂苷類成分含量均明顯升高，這一變化主要來(lái)源于黃芪皂苷Ⅰ和黃芪皂苷Ⅲ含量在2組處理中的顯著升高?？梢?jiàn)，菌株SXKF16-1和SXKF16-2對(duì)黃芪部分皂苷類藥效成分有促進(jìn)積累的作用。在黃酮類成分毛蕊異黃酮和芒柄花素的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，盡管2株菌處理后這2種成分的含量變化與對(duì)照相比無(wú)明顯差異，但不同的菌株處理間呈現(xiàn)出了差異性的變化。這一現(xiàn)象表明，不同的芽孢桿菌對(duì)黃芪藥效成分的影響并不完全相同，其原因可能在于不同的芽孢桿菌與黃芪的互作機(jī)制不同，進(jìn)而造成黃芪藥效成分產(chǎn)生或積累的差異。同時(shí)需注意的是，本研究測(cè)定的是拮抗菌發(fā)酵液整體對(duì)黃芪藥效成分的影響，體現(xiàn)的是菌體和發(fā)酵代謝產(chǎn)物共同作用的效果。因此，具體是何種因素對(duì)黃芪藥效成分的代謝變化起到主要作用，還需進(jìn)一步研究。

葉如夢(mèng)等[25]在營(yíng)養(yǎng)土環(huán)境中接種枯草芽孢桿菌B117顯著降低香蜂花總酚及迷迭香酸(RA)的含量，在相對(duì)貧瘠環(huán)境中接菌則沒(méi)有顯著影響，推測(cè)該菌株對(duì)香蜂花次級(jí)代謝產(chǎn)物的作用依賴于土壤營(yíng)養(yǎng)條件。由此，在后期深入評(píng)價(jià)菌株SXKF16-1和SXKF16-2對(duì)黃芪藥效成分含量的影響時(shí)，還應(yīng)考慮施用地土壤因素的作用。

測(cè)定中藥材有限成分的含量并不能全面、準(zhǔn)確地反映其質(zhì)量的優(yōu)劣[26]，本研究?jī)H針對(duì)黃芪的10種主要藥效成分進(jìn)行測(cè)定，無(wú)法反映其活性成分的整體變化。近年來(lái)，以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)的植物代謝組學(xué)技術(shù)在分析植物在非生物或生物脅迫下的應(yīng)答機(jī)制方面已經(jīng)取得了很大進(jìn)展[27]，并在中藥材質(zhì)量的整體評(píng)價(jià)中顯示出了巨大優(yōu)勢(shì)[26]。利用該技術(shù)研究芽孢桿菌對(duì)藥用植物活性成分的影響，將更有利于從整體變化的層面來(lái)準(zhǔn)確評(píng)價(jià)其作用。

另外，本試驗(yàn)中黃芪皂苷I的含量較其他文獻(xiàn)中報(bào)道的偏高。由文獻(xiàn)可知，黃芪中皂苷80%以上分布在表皮[28]，且總皂苷生長(zhǎng)3年含量達(dá)到最高，除3年生黃芪外，皂苷含量隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)含量逐漸降低[29]，可見(jiàn)黃芪的生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)皂苷含量有顯著影響。本試驗(yàn)所用黃芪的生長(zhǎng)時(shí)間僅有6個(gè)月，根相對(duì)較細(xì)，表皮在根重中占有較大的比例，這可能是導(dǎo)致所測(cè)得的皂苷含量與其他報(bào)道不盡一致的直接原因。

4 結(jié)論

黃芪根腐病拮抗芽孢桿菌SXKF16-1和SXKF16-2發(fā)酵液的施用，對(duì)黃芪黃酮類活性成分的積累無(wú)顯著影響，但可促進(jìn)皂苷類成分特別是黃芪皂苷Ⅰ和黃芪皂苷Ⅲ含量的升高，表明供試芽孢桿菌具有提高移栽黃芪藥效成分，改善其品質(zhì)的潛力，但不同菌株的作用效果具有一定差異。研究結(jié)果為將上述菌株開發(fā)為多功能制劑，針對(duì)性地緩解黃芪規(guī)模化生產(chǎn)中根腐病嚴(yán)重發(fā)生和主要藥效成分含量降低的問(wèn)題，提供了有效的理論依據(jù)。