不同溫度水楊酸引發(fā)對干旱脅迫下玉米種子發(fā)芽及幼苗生理特性的影響

侯林欣，呂 強(qiáng)，黃 明，焦念元，尹 飛，劉 領(lǐng)，呂 夢，付國占

（河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河南旱地農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河南洛陽 471003）

0 引言

玉米是中國種植面積最大、總產(chǎn)量最高的作物，玉米生產(chǎn)對中國國民經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定、國家糧食安全有著重要意義。近年來，隨著全球氣候變暖，中國玉米主產(chǎn)區(qū)干旱頻發(fā)，加上灌溉條件有限，干旱成為了玉米減產(chǎn)的主要環(huán)境因素[1-2]。尤其是播種期的干旱影響種子發(fā)芽出苗和適期播種，成為影響玉米生產(chǎn)的關(guān)鍵時(shí)期。種子完成萌發(fā)到出苗過程需水較少，但對外界水分十分敏感[3]。田錦芬[4]研究指出，田間最大持水量的65%是玉米完成萌發(fā)的閾值，土壤耕作層相對含水量＜65%時(shí)，不利于玉米種子萌發(fā)、幼苗生長以及根系伸長。

種子引發(fā)[5]是一項(xiàng)可以提高種子活力的播前處理措施，其將種子置于引發(fā)劑中，通過緩慢吸水過程完成發(fā)芽所需物質(zhì)的準(zhǔn)備后及時(shí)回干，再吸脹時(shí)種子可以迅速整齊發(fā)芽[6]，廣泛應(yīng)用于逆境條件下促進(jìn)水稻[7-9]、小麥[10-12]、玉米[13-15]等作物種子萌發(fā)。種子引發(fā)受多種因素調(diào)控，其中引發(fā)劑種類[16]、引發(fā)時(shí)間[17]和引發(fā)溫度[17-18]等是影響引發(fā)效果的關(guān)鍵因素。杜錦等[16]采用不同引發(fā)劑對玉米種子引發(fā)處理后，發(fā)現(xiàn)適宜濃度的PEG、SA、KCl、Na2SO4溶液引發(fā)顯著提高了干旱脅迫下玉米種子的發(fā)芽率、苗高、根長、植株干重和葉綠素含量，降低了電解質(zhì)滲出率，最終提高玉米芽苗期的耐旱性。李秀梅等[19]的研究結(jié)果表明，不同引發(fā)溫度均縮短了煙草種子的發(fā)芽時(shí)間，提高了種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢，并進(jìn)一步分析得出2個(gè)品種煙草種子的最佳引發(fā)溫度為15℃。同時(shí)王彥榮認(rèn)為[20]，種子引發(fā)操作對不同種和品種間的引發(fā)效果存在較大差異。

水楊酸(SA)作為一種內(nèi)源生理調(diào)節(jié)劑，廣泛存在于各類植物體內(nèi)。近些年研究表明，水楊酸可以參與調(diào)節(jié)植物（種子萌發(fā)、氣孔調(diào)節(jié)和植物開花等）多種生理生化活動(dòng)[21]，通過調(diào)控植物抗氧化代謝和控制細(xì)胞內(nèi)ROS含量，增強(qiáng)植物對干旱[22]、冷害[23]和高溫[24]等非生物脅迫的適應(yīng)能力，在提高植物抗逆能力方面有著重要的作用。楊若鵬等[25]研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的水楊酸引發(fā)處理可以提高干旱脅迫下黃瓜幼苗過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性，并降低幼苗丙二醛(MDA)含量，緩解干旱脅迫對黃瓜的過氧化損傷。高巧紅等[26]的研究表明，水楊酸引發(fā)增加了玉米種子低溫吸漲過程中胚、胚乳和種皮的可溶性蛋白含量，以及胚乳和種皮的過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性，降低種子浸出液中核苷酸含量，從而增強(qiáng)了種子在低溫脅迫下的萌發(fā)能力。

玉米種子引發(fā)已有較多報(bào)道[27-30]，而關(guān)于不同溫度水楊酸對不同基因型玉米種子的引發(fā)還鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)通過對不同溫度水楊酸引發(fā)玉米種子的發(fā)芽以及幼苗形態(tài)與生理指標(biāo)的測定與分析，探討引發(fā)溫度改變對水楊酸引發(fā)玉米幼苗形成的影響，同時(shí)進(jìn)一步了解主因素溫度在不同品種間是否存在差異，以期為種子引發(fā)技術(shù)在旱作玉米生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)以普通玉米‘鄭單958’(ZD958)、糯玉米‘京科糯2000’(JK2000)和甜玉米‘金甜808’(JT808)為試驗(yàn)材料，種子的初始含水量為13.7%。供試引發(fā)劑水楊酸(SA)由天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)。模擬干旱脅迫制劑聚乙二醇(PEG-6000)由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)在河南科技大學(xué)旱地農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，于2019年9月—2020年1月進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引發(fā)處理 用1 mmol/L濃度水楊酸引發(fā)（前期試驗(yàn)篩選的最適濃度），設(shè)置5、10、15、20℃ 4個(gè)引發(fā)溫度處理。選擇健康飽滿的種子，用5%次氯酸鈉溶液消毒3 min后用蒸餾水快速?zèng)_洗干凈，而后用吸水紙吸干種子表面水分。在墊有3層濾紙的培養(yǎng)皿中均勻擺放玉米種子，并加入適量引發(fā)溶液（溶液體積與種子質(zhì)量為1:3，即 1 g種子質(zhì)量:3 mL引發(fā)溶液）[31]，加蓋用Parafilm封口膜密封，分別置于5、10、15、20℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)，黑暗條件下引發(fā)24 h。引發(fā)結(jié)束后，用蒸餾水快速?zèng)_洗玉米種子并用吸水紙吸干表面水分，然后置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)25℃條件下回干至初始含水量。以消毒后未進(jìn)行引發(fā)的種子為對照。

1.2.2 發(fā)芽試驗(yàn) 取各處理種子30粒，放置于含有3層發(fā)芽紙的發(fā)芽盒內(nèi)（發(fā)芽盒規(guī)格為13 cm×19 cm，透光率為98%）并加入25 mL 10% PEG溶液，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期黑暗12 h/光照12 h，溫度均為25℃，光照強(qiáng)度為400 μmol/(m2·s)。發(fā)芽試驗(yàn)期間每天更換培養(yǎng)液。試驗(yàn)周期為7天，共設(shè)5次重復(fù)。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 發(fā)芽及形態(tài)指標(biāo)測定 以種子胚芽鞘長度1 cm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，從第3天開始每天記錄發(fā)芽數(shù)；第7天各重復(fù)取5株幼苗，測量其根長、苗高、地上部和地下部鮮重。在發(fā)芽3天和7天分別計(jì)算發(fā)芽勢和發(fā)芽率，并計(jì)算發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。各參數(shù)的計(jì)算見式(1)～(4)。

式中，Gt為第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽的天數(shù)，S為根苗鮮重。

1.3.2 生理指標(biāo)測定 第7天取各處理玉米幼苗地上部分進(jìn)行生理指標(biāo)測定。可溶性糖含量的測定采用蒽酮顯色法[32]；可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[32]；丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸法[33]；超氧化物歧化酶活性的測定采用氮藍(lán)四唑法[33]；過氧化物酶活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[33]；過氧化氫酶活的測定采用紫外比色法[33]；谷胱甘肽含量的測定采用Griffith[34]的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013處理原始數(shù)據(jù)并繪制圖表。在SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行方差分析(ANOVA)和多重比較（差異顯著性水平0.05）；同時(shí)運(yùn)用SPSS 22.0軟件對3個(gè)玉米品種測定的4個(gè)種子發(fā)芽指標(biāo)（發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)）和5個(gè)幼苗生長指標(biāo)（株高、地上重、根長、地下重和整株重）進(jìn)行歐式距離計(jì)算以及主成分分析，以特征值大于1提取主成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度水楊酸引發(fā)對種子發(fā)芽的影響

從表1看出，10% PEG溶液培養(yǎng)條件下，不同品種玉米種子經(jīng)不同溫度水楊酸引發(fā)后發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均高于CK，且大部分處理與CK間差異顯著；隨著引發(fā)溫度升高，不同品種玉米發(fā)芽指標(biāo)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。‘鄭單958’，引發(fā)處理與CK相比發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)平均提升了11.46%、14.70%、11.96%和19.69%，其中15℃處理最高，較CK各性狀指標(biāo)分別提升了16.67%、21.26%、17.69%和25.39%。‘金甜808’，引發(fā)處理與CK相比發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)平均提升了7.34%、9.38%、7.77%和19.23%，其中15℃處理最高，較CK各性狀指標(biāo)分別提升了10.88%、8.76%、10.02%和26.83%?！┛婆?000’，引發(fā)處理與CK相比發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)平均提升了10.30%、7.73%、9.30%和17.47%，其中10℃處理最高，較CK各性狀指標(biāo)分別提升了16.48%、10.73%、14.27%和32.00%。

表1 干旱脅迫下不同處理玉米種子發(fā)芽指標(biāo)

2.2 不同溫度水楊酸引發(fā)對幼苗生長的影響

10% PEG溶液培養(yǎng)條件下水楊酸引發(fā)玉米幼苗的各性狀表現(xiàn)均優(yōu)于CK（表2），不同品種玉米各指標(biāo)均表現(xiàn)為隨著溫度的升高而先升高后降低?！崋?58’，引發(fā)處理與CK相比株高、地上重、根長、地下重和整株重平均提升了4.18%、9.21%、17.70%、10.71%和11.08%，其中15℃處理最高，較CK各性狀指標(biāo)分別提升了8.19%、15.79%、26.25%、21.43%和20.25%?！鹛?08’，引發(fā)處理與CK相比株高、地上重、根長、地下重和整株重平均提升了13.29%、28.95%、42.45%、27.15%和10.87%，其中也以15℃處理最高，較CK各性狀指標(biāo)分別提升了15.43%、42.86%、72.96%、32.26%和16.74%。‘京科糯2000’，引發(fā)處理與CK相比株高、地上重、根長、地下重和整株重平均提升了17.80%、17.73%、13.32%、13.10%和6.81%，其中10℃處理最高，較CK各性狀指標(biāo)分別提升了 39.10%、36.36%、25.05%、21.90%和15.16%。從5個(gè)幼苗性狀指標(biāo)分析，引發(fā)處理明顯增加了‘鄭單958’和‘金甜808’的根長（17.70%和42.45%），而對‘京科糯2000’的株高和地上重（17.80%和17.73%）提升較大；且從均值分析來看‘金甜808’較其他品種引發(fā)效果明顯。

表2 干旱脅迫下不同處理玉米幼苗生長指標(biāo)

2.3 不同溫度水楊酸引發(fā)對幼苗生理指標(biāo)的影響

2.3.1 不同溫度水楊酸引發(fā)對幼苗抗氧化酶活性的影響 由圖1所示，10% PEG培養(yǎng)條件下水楊酸引發(fā)增強(qiáng)了玉米幼苗抗氧化酶活性；不同品種玉米抗氧化酶活性均表現(xiàn)為隨著引發(fā)溫度的升高而先升高后降低。‘鄭單958’各溫度處理SOD和CAT活性表現(xiàn)為15℃＞10℃＞20℃＞5℃＞CK，POD活性表現(xiàn)為15℃＞10℃＞5℃＞20℃＞CK，SOD、POD和CAT活性以15℃處理最高；‘金甜808’各溫度處理SOD活性表現(xiàn)為15℃＞20℃＞10℃＞5℃＞CK，POD和CAT活性表現(xiàn)為15℃＞10℃＞20℃＞5℃＞CK，SOD、POD和CAT活性同樣表現(xiàn)為15℃處理最高；‘京科糯2000’各溫度處理SOD、POD和CAT活性均表現(xiàn)為10℃＞15℃＞20℃＞5℃＞CK，以10℃處理最高。且不同品種玉米所有溫度處理均與對照存在顯著差異。

圖1 干旱脅迫下不同處理玉米幼苗抗氧化酶活性

2.3.2 不同溫度水楊酸引發(fā)對幼苗代謝物質(zhì)含量的影響 10% PEG培養(yǎng)條件下，水楊酸引發(fā)后顯著提高了不同品種玉米幼苗的谷胱甘肽(GSH)、可溶性糖(SS)和可溶性蛋白(SP)的含量，不同溫度引發(fā)處理間玉米幼苗的谷胱甘肽、可溶性糖和可溶性蛋白含量變化呈現(xiàn)出與抗氧化酶活性相同的規(guī)律變化，其中‘鄭單958’、‘金甜808’以15℃處理最高，‘京科糯2000’以10℃最高。而丙二醛(MDA)含量則表現(xiàn)為隨著溫度升高先減少后增多（圖2），‘鄭單958’、‘金甜808’以15℃處理最低，‘京科糯2000’以10℃最低。

圖2 干旱脅迫下不同處理玉米幼苗代謝物質(zhì)含量

2.4 聚類及主成分分析

由表3可以看出，‘鄭單958’各處理間的歐式距離范圍介于0.425～3.023，平均值為1.709。其中‘鄭單958’15℃處理與CK之間距離最大，10℃處理與15℃處理之間距離最小。說明對照與15℃引發(fā)效果差異最大，而10℃與15℃引發(fā)效果差異最小。進(jìn)一步分析可知‘鄭單958’最佳引發(fā)溫度為15℃，最佳引發(fā)溫度范圍為10～15℃。同理，‘金甜808’的最佳引發(fā)溫度為15℃，最佳引發(fā)溫度范圍為10～15℃（表4）；‘京科糯2000’的最佳引發(fā)溫度為10℃，最佳引發(fā)的溫度范圍為10～15℃（表5）?！┛婆?000’最佳引發(fā)溫度與其他2個(gè)品種不同的情況，說明不同品種對應(yīng)的最佳引發(fā)溫度存在差異。但由于各處理的最佳引發(fā)溫度范圍均為10～15℃，猜測水楊酸引發(fā)玉米的溫度范圍選擇應(yīng)為10～15℃。

表3 基于種子發(fā)芽和幼苗生長指標(biāo)的歐氏距離分析（鄭單958）

表4 基于種子發(fā)芽和幼苗生長指標(biāo)的歐氏距離分析（金甜808）

表5 基于種子發(fā)芽和幼苗生長指標(biāo)的歐氏距離分析（京科糯2000）

主成分分析特征值大于1的為主成分1和主成分2，其累積貢獻(xiàn)率高達(dá)70.423%和82.860%，說明主成分1和主成分2能代表9個(gè)指標(biāo)幾乎所有的信息（表6）。其中對主成分1影響較大的指標(biāo)是發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、地下重和整株鮮重；對主成分2影響較大的指標(biāo)為發(fā)芽率、地上重和根長。由此可見，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、地上重、根長、地下重和整株鮮重是反映不同溫度對玉米種子引發(fā)效果的最佳形態(tài)指標(biāo)。

表6 不同引發(fā)處理后種子發(fā)芽和幼苗生長相關(guān)指標(biāo)的主成分分析

3 討論與結(jié)論

水是種子萌發(fā)的必要條件。當(dāng)土壤含水量低于一定閾值時(shí)，種子無法利用水勢梯度完成吸漲過程，導(dǎo)致種子萌發(fā)停滯，影響種子發(fā)芽出苗[35]。本研究結(jié)果表明，水楊酸引發(fā)促進(jìn)了水分脅迫下玉米種子發(fā)芽和幼苗生長，這與張彩芳[36]研究結(jié)果相符?？赡苁怯捎谒畻钏嶙鳛橹参锷L調(diào)節(jié)劑，參與了引發(fā)過程中種子信號傳遞過程，縮短了種子發(fā)芽周期，使玉米種子更快表現(xiàn)出對干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制。

溫度是種子完成發(fā)芽的關(guān)鍵因素[37]，也是影響種子引發(fā)效果的重要環(huán)境條件。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同溫度水楊酸引發(fā)均能促進(jìn)玉米種子發(fā)芽成苗，但對不同品種玉米種子萌發(fā)和幼苗形成表現(xiàn)具有不同程度影響，適當(dāng)程度的低溫引發(fā)效果更佳。這與劉慧霞[38]、李秀梅等[19]、Chiu等[39]的研究結(jié)果一致。可能是因?yàn)榉N子引發(fā)保留了低溫萌動(dòng)過程對種子發(fā)芽耐逆性鍛煉的抗性記憶[40]。

植物可溶性糖參與逆境環(huán)境中植物的滲透調(diào)節(jié)。本研究中，水楊酸引發(fā)增加了玉米幼苗地上部可溶性糖與可溶性蛋白含量，有利于根系伸長以及維持根系滲透壓，保證幼苗吸水。這與馬超等[41]研究發(fā)現(xiàn)種子引發(fā)增加了小麥幼苗地上部可溶性糖含量結(jié)果一致。但與許高平[42]和李潔[15]的研究結(jié)果存在差異，他們認(rèn)為，外界脅迫條件下幼苗地上部可溶性糖主動(dòng)轉(zhuǎn)移到根部用于維持幼苗生長，導(dǎo)致幼苗地上部可溶性糖含量降低。所以關(guān)于此點(diǎn)還需進(jìn)一步研究證明。

逆境脅迫條件下，植物自身會(huì)產(chǎn)生大量活性氧負(fù)離子和氧化自由基，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷[43]。SOD、POD、CAT組成的抗氧化酶系統(tǒng)在逆境脅迫環(huán)境中積極參與清除植物體內(nèi)過度的自由基并減少丙二醛積累，從而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)維持植物正常代謝[44]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸引發(fā)提高了水分脅迫下玉米幼苗抗氧化酶活性，降低了丙二醛含量，減輕了種子萌發(fā)過程中膜脂過氧化程度，減少了細(xì)胞內(nèi)容物外滲，保證了種子萌發(fā)和幼苗建成的物質(zhì)代謝基礎(chǔ)。與馬超等[41]、Khampheng等[45]研究結(jié)果一致。同時(shí)各項(xiàng)生理指標(biāo)均表現(xiàn)出明顯的溫度效應(yīng)，也進(jìn)一步說明了溫度是影響種子引發(fā)效果的重要因素。

不同溫度(5、10、15、20℃)水楊酸引發(fā)均能改善水分脅迫下不同類型玉米種子萌發(fā)和幼苗生長狀況（發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、株高、地上重、根長、地下中、整株質(zhì)量）、幼苗生理特性（可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛、谷胱甘肽）以及抗氧化酶系統(tǒng)活性(SOD、POD、CAT)。引發(fā)溫度改變影響引發(fā)效果，適宜的引發(fā)溫度可以提高引發(fā)效果；不同基因型玉米最佳引發(fā)溫度存在差異，其中‘鄭單958’和‘金甜808’以15℃引發(fā)效果最佳，‘京科糯2000’以10℃引發(fā)效果最佳，并進(jìn)一步通過歐氏距離分析得出最佳引發(fā)溫度范圍為10～15℃。