毛竹根系解磷細(xì)菌的解磷條件和解磷特性

楊 豆，李廣強(qiáng)，呂永財(cái)，李 冬，萬(wàn)松澤，張 揚(yáng)

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) a.林學(xué)院；b.國(guó)家林業(yè)和草原局鄱陽(yáng)湖流域森林生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2.山東省棗莊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村事業(yè)發(fā)展中心，山東 棗莊 277000；3.山東省煙臺(tái)市芝罘林場(chǎng)，山東 煙臺(tái) 264002）

磷是植物體內(nèi)多種有機(jī)化合物的主要組成部分，在植物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中扮演著不可或缺的角色[1-2]。存在于土壤中的磷主要有難溶性磷和可溶性磷兩種[2]。目前，我國(guó)土壤中全磷的含量分布不均，整體自西北方向東南方呈遞減趨勢(shì)[3]。其中，南方丘陵紅壤地區(qū)其獨(dú)特的土壤性質(zhì)導(dǎo)致土壤中可溶性磷的含量過(guò)低，完全不能滿足植物生長(zhǎng)的需求，磷元素已成為該地區(qū)森林生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力提升的重要限制因子之一[4]。毛竹Phyllostachys edulis（Carrière）J.Houz.是我國(guó)南方地區(qū)重要的竹材樹(shù)種之一，其種植面積廣、材質(zhì)優(yōu)良且生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)[5]，在森林生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色[6]。然而，我國(guó)丘陵紅壤地區(qū)土壤有效養(yǎng)分的缺乏限制了竹林的可持續(xù)經(jīng)營(yíng)和發(fā)展，其中磷元素為其主要限制因子之一[7-8]。為了改善這種狀態(tài)，林農(nóng)常通過(guò)施用大量磷肥來(lái)緩解土壤缺磷問(wèn)題，而大量肥料中的可溶性磷進(jìn)入土壤后僅有不超過(guò)30%的磷素被植物吸收，剩余部分被土壤中金屬離子鰲合成難溶性磷酸鹽而固定在土壤中[9]。采用這種方法施肥，不僅會(huì)導(dǎo)致磷素利用率低，還會(huì)引起土壤板結(jié)和水體污染等一系列環(huán)境問(wèn)題的發(fā)生[10]。由于長(zhǎng)期施用磷肥，土壤中的全磷含量較高，潛在磷庫(kù)較大[11]，故有效開(kāi)發(fā)該磷庫(kù)，進(jìn)而提升土壤磷肥的有效性，可以緩解毛竹林地磷素缺乏的問(wèn)題。

隨著有關(guān)植物—微生物—土壤間互作關(guān)系的研究的深入，有關(guān)微生物對(duì)土壤有效養(yǎng)分含量提升的影響方面的研究漸漸成為相關(guān)研究的熱點(diǎn)。而且，與大量化學(xué)肥料相比，生物肥的綠色、高效等優(yōu)點(diǎn)已逐漸成為人們偏好施用的重要原因之一。生物肥中的解磷微生物除了具有能促使難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄粤椎哪芰ν猓€具有增強(qiáng)植株抗逆性等優(yōu)點(diǎn)[2,12]，因此，施用生物肥是一條解決竹林土壤養(yǎng)分缺乏問(wèn)題的有效生物途徑。目前，有關(guān)根際土壤解磷微生物篩選的研究已有不少報(bào)道：如張晶晶等[13]從核桃根際土壤中篩選出了11 株定殖能力較強(qiáng)的解磷細(xì)菌；莊馥璐等[14]從蘋果根際土壤中分離出了10 株具有不同解磷能力的解磷細(xì)菌；鄧小軍等[15]從林木根際土壤中篩選出了6 株透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）的比值大于1.2 的溶解無(wú)機(jī)磷的菌株。然而，內(nèi)生細(xì)菌生存于寄主植物組織內(nèi)，與根際土壤內(nèi)篩選出的菌株相比，具有較強(qiáng)定植能力與適應(yīng)性，同時(shí)可調(diào)節(jié)寄主植物體內(nèi)的微平衡[16]。越來(lái)越多的證據(jù)證明，根系作為植物體內(nèi)氮、磷等養(yǎng)分的重要吸收組織，存在著豐富的內(nèi)生細(xì)菌[17]，并通過(guò)分泌相關(guān)激素和酶等功能來(lái)增強(qiáng)植物對(duì)土壤中有效養(yǎng)分的吸收能力[18-20]。因此，從毛竹根系中篩選出具有高效解磷能力的內(nèi)生菌株，并將之研制成為生物肥料，這是一條緩解我國(guó)南方丘陵地區(qū)毛竹磷限制問(wèn)題、提升竹林生產(chǎn)力的有效途徑之一。而不同菌劑對(duì)其生長(zhǎng)環(huán)境的嗜好不同，其解磷能力也隨著環(huán)境的變化而變化，因此，有必要探討解磷菌株在不同營(yíng)養(yǎng)因子和不同環(huán)境條件下的解磷特性。為此，本課題組前期從毛竹根系中篩選到了具有多種生物功能的拉塔伯克霍爾德菌Burkholderia lataPN1，但關(guān)于該菌株的解磷特性尚不清楚。為了掌握B.lataPN1 菌株的解磷特性，從而為其在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)，本研究對(duì)該菌株的解磷特性及解磷條件進(jìn)行了研究，現(xiàn)將研究結(jié)果分析報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株P(guān)N1 由本課題組分離自江西省奉新縣大港林場(chǎng)內(nèi)毛竹根系，前期鑒定為拉塔伯克霍爾德菌Burkholderia lataPN1，保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌株保藏號(hào)為CCTCC NO：M 2019880。

1.2 供試培養(yǎng)基

供試的營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NB）培養(yǎng)基的配方為：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH 值為7.2～7.4。

供試的由國(guó)際植物研究所研制的磷酸鹽生長(zhǎng)液體培養(yǎng)基（NBRIP）的配方為：Ca3(PO4)25 g，葡萄糖10 g，KCl 0.2 g，MgCl25 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，(NH4)2SO40.1 g，水1 000 mL，pH 值為7.2～7.4。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)方法

1.3.1 不同碳、氮源對(duì)菌株P(guān)N1 解磷能力的影響試驗(yàn)

分別以可溶性淀粉、果糖、麥芽糖、蔗糖和葡萄糖為碳源配制NBRIP 液體培養(yǎng)基，保持培養(yǎng)基中其他成分不變；分別以牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、KNO3和(NH4)2SO4為氮源配制NBRIP 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中其他成分也保留不變。將所有配制后的培養(yǎng)基分別放置于100 mL的錐形瓶中，將菌株P(guān)N1 于NB 培養(yǎng)基內(nèi)活化后制備種子液，并以1%的接種量將菌株P(guān)N1 分別接種至上述裝有培養(yǎng)基的錐形瓶?jī)?nèi)。以等體積的沒(méi)有接種菌株的培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理組各設(shè)3 個(gè)重復(fù)。將各處理錐形瓶均置于溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min的條件下分別振蕩培養(yǎng)3 和6 d，然后取培養(yǎng)液置于溫度為4 ℃、轉(zhuǎn)速為10 000 r/min 的條件下離心10 min，吸取離心后的上清液0.1 mL 置于50 mL的容量瓶中，以2,4-二硝基酚為指示劑，采用鉬銻抗比色法[21]測(cè)定上清液中可溶性磷的濃度。

1.3.2 初始pH 值對(duì)菌株P(guān)N1 解磷能力的影響試驗(yàn)

將NBRIP 培養(yǎng)基的初始pH 值分別調(diào)至1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 這6 個(gè)水平，但NBRIP培養(yǎng)基的成分保持不變；以1%的接種量將菌株P(guān)N1 分別接種至上述不同初始pH 值的NBRIP 液體培養(yǎng)基內(nèi)，以等體積的沒(méi)有接種菌株的培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理各設(shè)3 個(gè)重復(fù)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件及上清液的測(cè)定方法與1.3.1 中所述的均同。

1.3.3 裝液量對(duì)菌株P(guān)N1 解磷能力的影響試驗(yàn)

分別將40、50、60、80 mL 的NBRIP 培養(yǎng)基加入到100 mL 的錐形瓶中，設(shè)裝液量與錐形瓶的體積比分別為2/5、1/2、3/5、4/5，并以1%的接種量將菌株P(guān)N1 分別接種至上述培養(yǎng)基內(nèi)，以等體積的沒(méi)有接種菌株的培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理各設(shè)3 個(gè)重復(fù)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件及上清液的測(cè)定方法與1.3.1 中所述的均同。

1.3.4 菌株P(guān)N1 對(duì)5 種難溶性磷酸鹽溶解能力的影響試驗(yàn)

在NBRIP 培養(yǎng)基的其他成分保留不變的前提下，分別以Ca3(PO4)2、FePO4、CaHPO4、AlPO4和植酸鈣5 種磷源配制NBRIP 培養(yǎng)基，以1%的接種量將種子液分別接入不同磷源的培養(yǎng)基中，對(duì)照為等體積的沒(méi)有接種菌株的培養(yǎng)基，每個(gè)處理各設(shè)3 個(gè)重復(fù)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件及上清液的測(cè)定方法與1.3.1 中所述的均同。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0 和Origin 2018 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。采用單因素方差分析法（ANOVA）檢驗(yàn)養(yǎng)分及環(huán)境因子對(duì)菌株P(guān)N1 解磷能力影響的差異（P＜0.05）；采用T檢驗(yàn)法檢驗(yàn)同一磷源不同處理天數(shù)間解磷能力的差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)菌株P(guān)N1 解磷能力的影響

NBRIP 培養(yǎng)基中的不同碳源對(duì)菌株P(guān)N1 溶磷效果的影響情況如圖1所示。由圖1可知，以果糖為唯一碳源時(shí)，菌株P(guān)N1 的解磷效果最好，培養(yǎng)3 和6 d 后發(fā)酵液中可溶性磷的濃度分別為176.83 與234.17 mg·L-1；其次為葡萄糖；蔗糖的解磷能力最差，培養(yǎng)3 和6 d 后發(fā)酵液中可溶性磷的濃度僅分別為37.00 和95.17 mg·L-1。此外，僅有以麥芽糖和蔗糖為碳源的培養(yǎng)時(shí)間存在顯著差異，且培養(yǎng)6 d 的菌株P(guān)N1 對(duì)磷酸三鈣的溶解能力最強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，用以果糖為碳源的NBRIP 培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d，菌株P(guān)N1 的溶磷效果最好。

圖1 以添加不同碳源的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)3 和6 d 后培養(yǎng)液中可溶性磷的濃度Fig.1 The soluble phosphorus concentration in the culture solution after 3 and 6 d of incubation with different carbon sources

2.2 氮源對(duì)菌株P(guān)N1 解磷能力的影響

不同氮源對(duì)菌株P(guān)N1 溶磷效果的影響情況如圖2所示。由圖2可知，以(NH4)2SO4為唯一氮源時(shí)，菌株P(guān)N1 的解磷能力最好，分別培養(yǎng)3 和6 d后其解磷濃度分別為142.83 與109.83 mg·L-1；以KNO3為氮源時(shí)，菌株P(guān)N1 的解磷能力次之；當(dāng)唯一氮源為酵母粉時(shí)，其解磷能力較低，培養(yǎng)6 d后其解磷濃度僅有53.00 mg·L-1；當(dāng)?shù)捶謩e為牛肉膏與蛋白胨時(shí)，菌株P(guān)N1 的解磷能力在相同的培養(yǎng)時(shí)間里無(wú)顯著差異，兩者可相互作為等效氮源使用。因此，菌株P(guān)N1 最適氮源為(NH4)2SO4且其培養(yǎng)時(shí)間為3 d。

圖2 以添加不同氮源的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)3 和6 d 后培養(yǎng)液中可溶性磷的濃度Fig.2 The soluble phosphorus concentration in the culture solution after 3 and 6 d of incubation with different nitrogen sources

2.3 初始pH 值對(duì)菌株P(guān)N1 解磷能力的影響

在不同初始pH 值的培養(yǎng)液中菌株P(guān)N1 對(duì)磷酸三鈣的溶解能力具有顯著差異（圖3）。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為3 d 時(shí)，菌株P(guān)N1 在初始pH 值為1.5 的培養(yǎng)液中具有最大解磷濃度，培養(yǎng)液中可溶性磷的濃度為190.50 mg·L-1；而當(dāng)培養(yǎng)液的初始pH 值為2.5～6.5 時(shí)，菌株P(guān)N1 對(duì)磷酸三鈣的溶解能力幾乎沒(méi)有影響，其解磷濃度為121.00～148.67 mg·L-1。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為6 d 時(shí)，在初始pH 值為5.5 的培養(yǎng)液中菌株P(guān)N1 的解磷濃度為119.83 mg·L-1，顯著高于其余幾個(gè)初始pH 值處理的解磷濃度。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間分別為3 和6 d 時(shí)，菌株P(guān)N1 在不同酸性環(huán)境下均有較好的解磷能力，試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株能適應(yīng)不同程度的酸性環(huán)境。

圖3 以不同初始pH 值的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)3 和6 d 后培養(yǎng)液中可溶性磷的濃度Fig.3 Concentration of soluble phosphorus in the medium after 3 and 6 d of incubation at different initial pH

2.4 裝液量對(duì)菌株P(guān)N1 解磷能力的影響

不同裝液量間菌株P(guān)N1 對(duì)磷酸三鈣的溶解能力具有顯著差異（圖4）。培養(yǎng)3 d 后，當(dāng)裝液量為錐形瓶體積的4/5 時(shí)，其解磷效果最好，解磷濃度為136.17 mg·L-1；當(dāng)裝液量為錐形瓶體積的1/2時(shí)，培養(yǎng)3 和6 d 的解磷濃度相近；培養(yǎng)6 d 后，當(dāng)裝液量為錐形瓶體積的2/5 時(shí)，其解磷效果最好，解磷濃度為187.33 mg·L-1。這一試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，培養(yǎng)后期菌株P(guān)N1 對(duì)環(huán)境氧量有較高的需求。

圖4 不同裝液量條件下培養(yǎng)3 和6 d 后培養(yǎng)液中可溶性磷的濃度Fig.4 Concentration of soluble phosphorus in the medium after 3 and 6 d of incubation at different liquid volume ratio

2.5 菌株P(guān)N1 對(duì)5 種難溶性磷酸鹽的溶解能力

以添加不同磷源的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)3 和6 d 后培養(yǎng)液中可溶性磷的濃度如圖5所示。由圖5可知，菌株P(guān)N1 對(duì)5 種磷源的溶解能力有著顯著差異。其對(duì)無(wú)機(jī)磷源CaHPO4的解磷能力最好，培養(yǎng)3 和6 d 后其解磷濃度分別為480.00 與161.00 mg·L-1；其次為Ca3(PO4)2，培養(yǎng)6 d 后其解磷能力最好，其解磷濃度為117.50 mg·L-1。菌株P(guān)N1 不僅對(duì)無(wú)機(jī)磷源表現(xiàn)出較好的溶解能力，同時(shí)對(duì)有機(jī)磷源植酸鈣也具有較好的溶解能力，培養(yǎng)3 和6 d 后其解磷濃度分別為82.00 與5.99 mg·L-1。但是，菌株P(guān)N1 對(duì)磷源AlPO4和FePO4均無(wú)溶解能力。

圖5 以添加不同磷源的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)3 和6 d 后培養(yǎng)液中可溶性磷的濃度Fig.5 The soluble phosphorus concentration in the culture solution after 3 and 6 d of incubation with different phosphorus sources

3 結(jié)論與討論

碳水化合物是所有異養(yǎng)微生物的能源物質(zhì)之一，對(duì)微生物生長(zhǎng)和繁殖具有不可替代的作用，且不同碳水化合物對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育速度的影響有著顯著差異[22]。有關(guān)研究結(jié)果表明，解磷微生物主要通過(guò)葡萄糖氧化代謝途徑分泌有機(jī)酸來(lái)溶解不溶性礦質(zhì)磷酸鹽[23]；菌絲分泌物中的果糖不僅能為植株提供碳源，還能作為信號(hào)分子提高細(xì)菌磷酸酶相關(guān)基因的表達(dá)[24]。研究中發(fā)現(xiàn)，菌株P(guān)N1在碳源為果糖或葡萄糖的培養(yǎng)液中的解磷能力最好。由此推測(cè)，該菌株可能是通過(guò)吸收利用果糖來(lái)提高磷酸酶相關(guān)基因表達(dá)的，或者通過(guò)吸收利用葡萄糖進(jìn)入氧化代謝途徑，進(jìn)而更好地促進(jìn)溶解難溶性的磷酸鹽的功能。不同的解磷菌株對(duì)碳源的適應(yīng)性不同。陳言柳等[25]發(fā)現(xiàn)，菌株NC285的最佳碳源為葡萄糖；鄭喜清等[26]發(fā)現(xiàn)，菌株P(guān)B3 在以葡萄糖或果糖為碳源的條件下其解磷效果最顯著。供試菌株P(guān)N1 對(duì)不同碳源條件表現(xiàn)出不同的溶解能力且其差異顯著，但其具體的代謝途徑和機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。氮是構(gòu)成微生物細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)的重要元素，對(duì)微生物的繁殖和代謝均有重要影響，也顯著影響著微生物生長(zhǎng)繁殖的速度[27]。Wenzel 等[28]對(duì)從Telopea speciosissima(Sm.) R.Br.的根際中分離到的解磷細(xì)菌進(jìn)行了氮源影響試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)礊镹H4+時(shí)其解磷能力較強(qiáng)，而用NO3-替換NH4+作為氮源時(shí)其幾乎沒(méi)有解磷活性。研究結(jié)果雖然驗(yàn)證了菌株P(guān)N1 在氮源為NH4+時(shí)其對(duì)磷酸鹽具有較好的溶解能力這一結(jié)論，然而，該菌株在氮源為NO3-時(shí)也表現(xiàn)出較好的解磷能力，這表明該菌株對(duì)不同氮源的適應(yīng)性均較強(qiáng)，其對(duì)氮源的可利用范圍更寬。

除營(yíng)養(yǎng)條件外，環(huán)境條件也會(huì)直接影響解磷微生物的解磷特性[29]，如培養(yǎng)液的初始pH 值、裝液量、磷源等因素。上官亦卿等[30]在對(duì)菌株JYP9解磷特性的研究中發(fā)現(xiàn)，除最適pH 值外，過(guò)酸或過(guò)堿的條件都會(huì)顯著影響其解磷量。我國(guó)南方土壤環(huán)境因子復(fù)雜，土壤酸度、氧氣濃度等變化均較大。而試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株P(guān)N1 在培養(yǎng)液的初始pH 值為2.5～6.5 的條件下其解磷能力并無(wú)顯著差異，這表明該菌株能夠適應(yīng)較廣的土壤酸度。此外，菌株的生長(zhǎng)要經(jīng)歷延滯期、對(duì)數(shù)期和衰退期等階段，試驗(yàn)觀測(cè)結(jié)果顯示，菌株P(guān)N1 在不同時(shí)間段其解磷功效會(huì)發(fā)生顯著變化。因此，今后在對(duì)該菌株發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，還應(yīng)將發(fā)酵時(shí)間當(dāng)作一個(gè)重要因子加以考慮，以獲得更高的解磷功效。

目前關(guān)于解磷微生物的解磷機(jī)制存在不同的說(shuō)法[31-32]。部分研究者認(rèn)為，它通過(guò)以解磷過(guò)程中釋放出的有機(jī)酸結(jié)合土壤中金屬離子的螯合作用來(lái)增強(qiáng)土壤中磷酸根離子的活性[33-34]；也有研究者認(rèn)為，其通過(guò)向外分泌各種與溶解磷酸鹽有關(guān)的酶（如磷酸酶、植酸酶、核酸酶等）來(lái)增加土壤有效磷酸鹽的濃度[35]；但也存在菌株同時(shí)具有這兩種解磷機(jī)制的研究結(jié)論[36]。以往的研究結(jié)果表明，解磷微生物對(duì)不同土壤類型中Ca3(PO4)2、FePO4和AlPO4等難溶性磷酸鹽的溶解能力具有顯著差異[31,37]，其原因可能是，解磷微生物對(duì)Ca3(PO4)2的溶解可通過(guò)分泌有機(jī)酸和質(zhì)子來(lái)絡(luò)合和溶解難溶性磷酸鹽，而對(duì)AlPO4、FePO4等的溶解僅能通過(guò)絡(luò)合作用進(jìn)行[38]。本研究初步探析了菌株P(guān)N1 的溶解特性，但該菌株對(duì)5 種難溶性磷酸鹽的溶解機(jī)制尚不清晰，同時(shí)該菌株是否具有分泌有機(jī)酸或各種酶類物質(zhì)等功能還有待進(jìn)一步研究。我國(guó)丘陵紅壤區(qū)中無(wú)機(jī)態(tài)磷主要以閉蓄態(tài)Fe-P 和Al-P 為主，堿性石灰土中主要以Ca-P 為主。研究結(jié)果顯示，菌株P(guān)N1 更適用于石灰土或Ca-P含量較多的土壤。本研究采用單因素試驗(yàn)對(duì)菌株P(guān)N1 的廣適性進(jìn)行了初步探討，研究結(jié)果為后續(xù)的正交或響應(yīng)面試驗(yàn)中發(fā)酵條件的優(yōu)化提供了參考數(shù)據(jù)，也為該菌株的推廣利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。