毛竹PheERF5基因克隆及生物信息學(xué)分析

胡俊東，吳惠俐，2，呂 浩-3

（1.湖南省森林植物園，湖南 長(zhǎng)沙 410116；2.長(zhǎng)株潭城市群森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站，湖南 長(zhǎng)沙 410116；3.中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

植物整個(gè)生命過程中，會(huì)遭受各種各樣的逆境脅迫影響，主要逆境環(huán)境因子如干旱、水澇、高溫、低溫、鹽堿脅迫等均限制著植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、生產(chǎn)力和地理分布，并降低了植物的潛在利用價(jià)值。環(huán)境脅迫或病原菌侵染會(huì)誘導(dǎo)或抑制植物中一系列具有多種功能的基因的響應(yīng)表達(dá)，從而誘導(dǎo)抗逆功能蛋白大量合成，以適應(yīng)環(huán)境或抵御病原菌侵染[1-3]。這些功能蛋白可分為2 類：功能性蛋白和調(diào)節(jié)性蛋白。轉(zhuǎn)錄因子是重要的調(diào)節(jié)蛋白，在誘導(dǎo)抗逆功能基因表達(dá)或功能蛋白合成方面發(fā)揮著非常重要的作用。AP2/ERF（APETALA2/ethylene responsive factor）轉(zhuǎn)錄因子家族是植物體中較大且較為重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其至少包含1 個(gè)由60～70 個(gè)氨基酸殘基組成的AP2 保守結(jié)構(gòu)域，這些氨基酸殘基在蛋白功能（如脅迫防御功能）決定方面具有重要作用。根據(jù)編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域數(shù)量和基因的功能，AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族可被分為4 個(gè)亞家族：AP2、RAV、DREB 和ERF[4-5]。AP2 亞家族轉(zhuǎn)錄因子基因編碼2 個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域，在調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要功能，如葉片表皮細(xì)胞形成、花和胚珠發(fā)育、小穗分生組織形成和種子生長(zhǎng)。RAV 亞家族轉(zhuǎn)錄因子具有1 個(gè)AP2 保守結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)類B3 結(jié)構(gòu)域，在響應(yīng)乙烯、油菜素類固醇以及生物和非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮作用，且能調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因的表達(dá)。DREB和ERF 亞家族轉(zhuǎn)錄因子由于參與植物抗生物和非生物脅迫而受到廣泛關(guān)注。DREB 亞家族轉(zhuǎn)錄因子通過識(shí)別脫水應(yīng)答元件（dehydration-responsive element，DRE）而在植物抗非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，DRE 的核心基序?yàn)锳/GCCGAC[6]。ERF亞家族轉(zhuǎn)錄因子通過識(shí)別順式作用元件GCC box（核心基序?yàn)锳GCCGCC）參與植物響應(yīng)生物脅迫過程，如病原菌侵染[7]。也有研究報(bào)道指出，ERF 亞家族轉(zhuǎn)錄因子具有抗非生物脅迫的功能[8-9]。

目前，ERF 亞家族轉(zhuǎn)錄因子的功能尚不明確，尤其是其在抗非生物脅迫方面的功能。響應(yīng)植物生物和非生物脅迫表達(dá)的ERF 轉(zhuǎn)錄因子被大量報(bào)道。比如，小麥Triticum aestiνum的TaERF3基因在高鹽和干旱脅迫時(shí)上調(diào)表達(dá)[8]；番茄Solanum pimpinellifolium的SpERFs基因響應(yīng)高鹽脅迫而表達(dá)[9]；蘋果Malus baccata的MbERF11基因超表達(dá)能提高擬南芥抗低溫和抗鹽脅迫的能力[3]；水稻Oryza satiνa的OsERF101基因可提高水稻幼苗的抗旱性，從而提高其定植率[10]；橡膠樹Heνea brasiliensis的HbERF1基因?yàn)橐蚁╉憫?yīng)基因和耐旱性基因的正調(diào)控子，受脫落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）和乙烯（ETH）等激素誘導(dǎo)表達(dá)[11]；煙草Nicotiana tabacum的Pti4/5/6 轉(zhuǎn)錄因子能識(shí)別致病相關(guān)基因啟動(dòng)子并與其結(jié)合，增強(qiáng)煙草的抗病性[12]；Tsi1基因在煙草中超表達(dá)能提高其抗病原菌侵染和滲透脅迫的能力[1]。轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)逆境脅迫的功能取決于其特殊的氨基酸序列和生物信息結(jié)構(gòu)[6-7]，因此，進(jìn)行ERF 轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列分析和生物信息學(xué)分析對(duì)預(yù)測(cè)其功能具有重要作用。

毛竹Phyllostachys edulis是禾本科Gramineae竹亞科Bambusoideae 剛竹屬Phyllostachys多年生喜溫常綠植物。毛竹原產(chǎn)于中國(guó)，其栽培面積大、分布范圍廣、生長(zhǎng)速度快，是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)竹種[13-15]。然而，自然界中廣泛存在各種非生物脅迫因子（如干旱、低溫、高鹽、洪水、水淹等）和生物脅迫因子（如病原菌侵染等），不利于毛竹的生長(zhǎng)發(fā)育，影響了出筍率、竹材材質(zhì)等，還限制了毛竹的分布范圍，嚴(yán)重影響了毛竹的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。然而，關(guān)于毛竹AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的遺傳結(jié)構(gòu)和功能研究多針對(duì)DREB 亞家族轉(zhuǎn)錄因子[16-17]，對(duì)于ERF 亞家族轉(zhuǎn)錄因子的研究鮮見報(bào)道。本研究中從毛竹幼苗葉片中克隆ERF 轉(zhuǎn)錄因子基因PheERF5并開展生物信息學(xué)分析，旨在為深入研究毛竹ERF 亞家族轉(zhuǎn)錄因子成員的抗逆功能和抗逆機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)

毛竹種子采集地點(diǎn)為廣西省桂林市。將毛竹種子置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中暗培養(yǎng)催芽，約2 周后將毛竹實(shí)生苗轉(zhuǎn)移至直徑為15 cm 的塑料花盆中，栽培基質(zhì)為蛭石。于光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為白天25 ℃、夜晚18 ℃，光周期為光16 h、暗8 h，濕度為80%，每周澆1 次Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 PheERF5 基因全長(zhǎng)序列克隆

使用Trizol Reagent（Invitrogen 公司）提取毛竹實(shí)生苗葉片總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司）合成cDNA 第一鏈，合成產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。根?jù)毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中PheERF5基因的CDS 序列，通過引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5 設(shè)計(jì)PCR 特異擴(kuò)增引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成?？寺∫餅镻heERF5-BamHI-F（5′TAGGATCCATGAATAGCGTGCAGG AAGAA3′）、PheERF5-HindIII-R（5′ATAAGCTT TTAAGCCTCCAGATCGGTGAA3′）。上游引物5′端加BamHI 酶切位點(diǎn)，下游引物5′端加HindIII酶切位點(diǎn)。

通過RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10 μL 2×PCR 混合緩沖液（Mg2+15 μmol/L）、1 μL 正向引物（10 pmol/L）、1 μL 反向引物（10 pmol/L）、2 μL 模板cDNA、6 μL ddH2O，總體積20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35 個(gè)循環(huán)，再72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析后，使用膠回收試劑盒（QIAGEN公司）回收目的產(chǎn)物。將回收的目的DNA 片段連接到pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌Esherichia coli，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，獲得陽性克隆質(zhì)粒，BamHI 和HindIII 雙酶切檢測(cè)，并送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將正確的重組質(zhì)粒命名為pMD18T-PheERF5。

1.3 PheERF5 蛋白生物信息學(xué)分析

使用SMART：Main page 軟件在線分析PheERF5蛋白氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域及其位置，使用Prot-Param 軟件在線分析該蛋白的理化性質(zhì)，使用ProtScale 軟件在線分析蛋白的親疏水性，使用NetPhos 3.1 軟件在線分析蛋白磷酸化位點(diǎn)，使用TMHMM Server v.2.0 軟件在線分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，使用SignalP-5.0 Server 軟件在線分析蛋白信號(hào)肽，使用wolf-psort、Cell PLoc 2.0 和Softberry（ProtComp 9.0）軟件在線分析蛋白亞細(xì)胞定位。分別使用SOPMA 和Swiss Model 軟件分析PheERF5 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用DNAMAN7.0 軟件進(jìn)行PheERF5 蛋白及其他物種同源蛋白多序列比對(duì)，使用MEGA 6.0 軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建PheERF5 蛋白和水稻AP2/ERF 家族成員蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。其他物種同源蛋白和水稻AP2/ERF 家族蛋白均從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載。

2 結(jié)果與分析

2.1 PheERF5 基因的克隆

使用PheERF5-BamHI-F 和PheERF5-HindIII-R引物，通過RT-PCR 反應(yīng)擴(kuò)增目的基因，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，EB 顯色后，在約1 000 bp 處有1 條清晰的亮帶，與目的基因片段大小相符。切膠回收，將回收產(chǎn)物與pMD18-T easy 載體連接，提取陽性克隆質(zhì)粒，經(jīng)BamHI 和HindIII 雙酶切后得到的片段大小與PCR 產(chǎn)物大小相吻合。

圖1 PheERF5 基因PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR amplification electrophoresis products of PheERF5 gene

PheERF5基因CDS 區(qū)堿基序列及其編碼的氨基酸序列如圖2所示。由圖2可以看出，獲得的cDNA 片段長(zhǎng)度為1 017 bp，共編碼339 個(gè)氨基酸，與毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中目的基因的長(zhǎng)度及氨基酸序列完全符合。

圖2 PheERF5 基因CDS 區(qū)堿基序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 The base sequence and deduced amino acid sequence of PheERF5 CDS region

氨基酸序列分析結(jié)果表明，PheERF5 蛋白保守結(jié)構(gòu)域存在1 個(gè)AP2 結(jié)構(gòu)域和4 個(gè)Low complexity，如圖3所示。由圖3可以看出，根據(jù)位置先后排序各保守結(jié)構(gòu)域分別位于第29～35 位、第60～74 位、第119～182 位、第200～220 位和第239～256 位氨基酸殘基處。由于該氨基酸序列具有1 個(gè)AP2 保守結(jié)構(gòu)域，由64 個(gè)氨基酸殘基組成，結(jié)構(gòu)域第14 位和第19 位氨基酸殘基分別為丙氨酸（A）和天冬酰胺（N），推測(cè)其屬于AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族的ERF 亞家族，故將其命名為PheERF5基因（PH01001057G0620）。

圖3 PheERF5 蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 The conserved domain prediction of PheERF5 protein

2.2 PheERF5 蛋白理化性質(zhì)

PheERF5 蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，其相對(duì)分子質(zhì)量為35 958.87 Da，分子結(jié)構(gòu)式為C1568H2453N435O517S9，總原子數(shù)為4 982，理論等電點(diǎn)為4.58，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白，其不穩(wěn)定系數(shù)為58.58，脂肪族氨基酸指數(shù)69.59。帶正電荷殘基（Arg+Lys）共31 個(gè)，帶負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）共55 個(gè)，表明該蛋白在中性條件下帶負(fù)電荷。

PheERF5 蛋白親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，PheERF5 蛋白在第140 位氨基酸殘基處親水性最強(qiáng)，親水系數(shù)為-2.756；在第50 位氨基酸殘基處疏水性最強(qiáng)，親水系數(shù)為1.733。PheERF5 蛋白序列中疏水性氨基酸殘基（分值大于0）占23.89%，親水性氨基酸殘基（分值小于0）占76.11%，總平均親水性系數(shù)-0.533，由此推測(cè)PheERF5 蛋白為親水性蛋白。

圖4 PheERF5 蛋白親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of PheERF5 protein

2.3 PheERF5 蛋白磷酸化位點(diǎn)

PheERF5 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，PheERF5 蛋白鏈中可能磷酸化且發(fā)生分值大于0.5 的氨基酸殘基位點(diǎn)有48個(gè)，其中蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)12 個(gè)，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)322 個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)4 個(gè)。PheERF5蛋白鏈主要磷酸化位點(diǎn)為絲氨酸殘基位點(diǎn)，由此推測(cè)其生物功能是以通過絲氨酸磷酸化修飾調(diào)控為主，以通過蘇氨酸磷酸化修飾調(diào)控為輔。

圖5 PheERF5 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.5 Phosphorylation site prediction of PheERF5 protein

2.4 PheERF5 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞定位

PheERF5 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)，屬于非跨膜蛋白。PheERF5 蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)如圖6所示。由圖6可以看出，該蛋白存在信號(hào)肽的概率僅有0.22%，由此推導(dǎo)出PheERF5 蛋白是非分泌蛋白。Wolf-psort 軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，PheERF5 蛋白質(zhì)位于細(xì)胞核的得分最高，為13，位于葉綠體和線粒體的得分分別為1 和0 分；CellPLoc 2.0 軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，PheERF5 蛋白質(zhì)位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)；Softberry軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白位于細(xì)胞核。因此，可推測(cè)PheERF5 蛋白的亞細(xì)胞定位為細(xì)胞核。

圖6 PheERF5 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.6 Prediction of signal peptide of PheERF5 protein

2.5 PheERF5 蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)

PheERF5 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，PheERF5 蛋白肽鏈中含有99 個(gè)α-螺旋（29.29%），36 個(gè)延伸鏈（10.65%），15個(gè)β-轉(zhuǎn)角（4.44%），188個(gè)無規(guī)則卷曲（55.62%），據(jù)此推測(cè)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲。

PheERF5 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖8所示。由圖8可以看出，PheERF5 蛋白質(zhì)的存在形式為單體蛋白，含有1 個(gè)α-螺旋，3 個(gè)β-折疊，組分間以β-轉(zhuǎn)角相連。

圖8 PheERF5 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.8 The tertiary structure of PheERF5 protein

2.6 PheERF5 基因同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PheERF5基因序列同源性的Blast 比對(duì)分析，結(jié)果如圖9所示。由圖9可以看出，PheERF5基因編碼的蛋白序列與小米Setaria italica、水稻Oryza satiνa、二穗短柄草Brachypodium distachyon、狗尾草Setaria νiridis、節(jié)節(jié)麥Aegilops tauschii、大麥Hordeum νulgare、疣粒野生稻Oryza meyeriana、小麥、Dichanthelium oligosanthes、玉米Zea mays高粱Sorghum bicolor的同源性高達(dá)84%以上，分別為85%、84%、85%、85%、85%、85%、84%、99%、85%、85%、98%，其氨基酸序列與這些物種的氨基酸序列的一致性達(dá)到64.29%。這些氨基酸序列的AP2 保守結(jié)構(gòu)域的同源性較高，共有37個(gè)保守氨基酸，分別是2F、4G、5V、6R、8R、9P、11G、13Y、14A、15A、16E、17I、18R、20P、23R、25R、27W、28L、29G、30T、31F、32D、33T、34A、35E、36E、37A、38A、41Y、42D、45A、46I、48L、50G、53A、56N、57F。

圖9 PheERF5 蛋白與其他物種同源蛋白AP2 結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.9 Multiple amino acid sequence alignment of the AP2 domains of PheERF5 protein with homologous proteins of other pecies

將PheERF5 蛋白的氨基酸序列與水稻已知的124 個(gè)AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖10所示。由圖10可以看出，PheERF5基因與水稻基因ERF 亞族B-5 組基因（Os12g41030、Os05g25260、Os03g60120、Os06g06540、Os01g12440和Os01g46870）聚為一支，且與Os12g41030進(jìn)化關(guān)系最近。

圖10 PheERF5 蛋白與水稻中124 個(gè)AP2/ERF 家族成員蛋白聚類Fig.10 Cluster analysis of PheERF5 protein from Phyllostachys edulis and 124 AP2/ERF family proteins from Oryza sativa

3 結(jié)論與討論

本研究中從毛竹幼苗葉片中克隆獲得了PheERF5基因的cDNA 片段，其序列全長(zhǎng)為1 017 bp，編碼339 個(gè)氨基酸。PheERF5基因編碼蛋白為具有1 個(gè)AP2 保守結(jié)構(gòu)域、無跨膜結(jié)構(gòu)、無信號(hào)肽、定位于細(xì)胞核且?guī)ж?fù)電荷的不穩(wěn)定的親水性蛋白。通過NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast 比對(duì)分析，結(jié)果表明PheERF5基因編碼氨基酸序列與禾本科植物（如小米、水稻、二穗短柄草等）ERF 蛋白氨基酸序列親緣關(guān)系近，其同源性均達(dá)到84%以上。通過構(gòu)建PheERF5 與124 個(gè)水稻AP2/ERF 家族成員氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析結(jié)果顯示，PheERF5與Os12g41030 親緣關(guān)系最近，且與水稻ERF 亞家族B-5 子組成員聚類為一支，這說明PheERF5是典型的ERF 亞家族轉(zhuǎn)錄因子。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，PheERF5 轉(zhuǎn)錄因子可能在毛竹抗生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。

植物體中ERF 亞家族轉(zhuǎn)錄因子是AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子較豐富的亞家族，水稻基因組中含有77 個(gè)ERF 亞家族成員[7]，玉米基因組中含有153個(gè)ERF 亞家族成員[18]，小麥基因組中含有47 個(gè)ERF 亞家族成員[19]，毛竹基因組中含有53 個(gè)ERF亞家族成員[17]，擬南芥基因組中含有65 個(gè)ERF亞家族成員[5]。ERF 亞家族參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過程，響應(yīng)生物和非生物環(huán)境脅迫[3,20]。比如，水稻OsEBP-89基因在胚乳和維管束韌皮部表達(dá)，尤其在莖節(jié)和居間分生組織鄰近部位高水平表達(dá)，表明ERF 轉(zhuǎn)錄因子可能參與胚乳細(xì)胞和頸部組織淀粉的積累；轉(zhuǎn)基因擬南芥和轉(zhuǎn)基因煙草中超表達(dá)ERF 類基因，提高了病原相關(guān)蛋白基因的表達(dá)量，顯著增強(qiáng)了植物對(duì)腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌、細(xì)菌性葉斑病、煙草花葉病毒等的抗性；在反義品系中，水稻OsERF3負(fù)調(diào)控降低了褐飛虱雌成蟲的采食量、產(chǎn)卵量及初孵若蟲的成活率，在過量品系中與之相反，表明OsERF3超表達(dá)可調(diào)節(jié)水稻通過防御昆蟲取食而提高對(duì)昆蟲的抵抗力；在番茄植株體內(nèi)煙草TERF2基因過量表達(dá)，可提高番茄對(duì)低溫脅迫的耐受性[21-22]。ERF 轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答的作用機(jī)理與其基因結(jié)構(gòu)和蛋白序列特征緊密相連，因此，研究毛竹ERF 亞家族成員的生物信息結(jié)構(gòu)和功能對(duì)揭示毛竹生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆機(jī)制具有重要的意義。

PheERF5 蛋白的AP2 結(jié)構(gòu)域由63 個(gè)氨基酸殘基組成，其結(jié)構(gòu)域第14 位氨基酸為丙氨酸（A），這與ERF 亞家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域第14 位特征氨基酸一致，但是，PheERF5 蛋白結(jié)構(gòu)域第19 位氨基酸為天冬酰胺（N），與ERF 亞家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域第19 位特征氨基酸（天冬氨酸D）不一致。這可能與ERF 轉(zhuǎn)錄因子AP2 結(jié)構(gòu)域第14 位氨基酸為極度保守氨基酸，而第19 位氨基酸的保守性較低有關(guān)[23]。PheERF5基因編碼氨基酸磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其存在48 個(gè)可能發(fā)生磷酸化的氨基酸殘基位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子通過磷酸化調(diào)控來誘導(dǎo)或抑制抗逆功能基因的表達(dá)，特定氨基酸殘基磷酸化可能影響轉(zhuǎn)錄因子的核定位、轉(zhuǎn)錄活性或與之互作的其他蛋白[12]。所以，PheERF5 轉(zhuǎn)錄因子可能通過氨基酸殘基磷酸化來響應(yīng)逆境脅迫，提高毛竹的耐逆性。

ERF 亞家族B-5 子組轉(zhuǎn)錄因子也被命名為細(xì)胞分裂素反應(yīng)因子（cytokinin response factors，CRFs），已被證實(shí)參與植物抗生物和非生物脅迫過程[24]。比如，Kwon[24]報(bào)道，過表達(dá)AtCRF2的擬南芥轉(zhuǎn)基因植物顯示出加速的葉片衰老表型，極端的AtCRF2過表達(dá)在生長(zhǎng)早期具有致命性，植物葉片呈現(xiàn)出病態(tài)表型。此外，受相容性半營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌病原體丁香假單胞菌變種（番茄DC3000）的侵染后，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株受到的危害更大。經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AtCRF2的表達(dá)與病原相關(guān)基因有較強(qiáng)的相關(guān)性，然而過表達(dá)AtCRF2的轉(zhuǎn)基因植株的表型完全受細(xì)菌水楊酸羥化酶NahG 表達(dá)的抑制[24]。這些研究結(jié)果表明，AtCRF2可能增強(qiáng)水楊酸（SA）的生物合成，導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)和葉片衰老。Zhou 等[12]通過酵母雙雜試驗(yàn)，鑒定了3 個(gè)B-5 子組基因Pti4、Pti5、Pti6，其所編碼的蛋白能與致病相關(guān)蛋白結(jié)合，上調(diào)抗細(xì)菌性斑點(diǎn)病基因的表達(dá)。Park 等[1]從煙草中克隆了Tsi1基因，發(fā)現(xiàn)其不僅能被鹽脅迫處理誘導(dǎo)表達(dá)，還能被乙烯利和水楊酸處理誘導(dǎo)表達(dá)。Park 等[1]還發(fā)現(xiàn)，Tsi1基因在植物體內(nèi)超表達(dá)，能誘導(dǎo)一系列致病相關(guān)基因在正常生長(zhǎng)條件下表達(dá)，從而提高植株的耐鹽性和抗病能力。Hasan 等[25]分析了干旱脅迫過程中3 個(gè)棉花品種相關(guān)響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，研究結(jié)果表明3 個(gè)棉花品種的CRF1基因均響應(yīng)干旱脅迫轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但表達(dá)水平不一致。由此可推斷，PheERF5基因參與毛竹抗生物和非生物逆境過程，尤其是抗病原菌過程。

本研究中雖然獲得了PheERF5基因的cDNA片段且對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，但尚未對(duì)PheERF5基因功能進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)通過進(jìn)一步的研究（如酵母自激活、亞細(xì)胞定位、遺傳轉(zhuǎn)化等）驗(yàn)證其功能。