福建七葉一枝花組織培養(yǎng)及主效成分測(cè)定

羅曉鋒，周建金，葉煒，喬鋒，廖承樹

(三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，福建 沙縣 365500)

2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，中藥重樓為百合科植物云南重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七葉一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根莖[1]。七葉一枝花的主要有效成分是甾體皂苷，其皂苷元主要為異螺甾烷醇類的薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，七葉一枝花具有抗腫瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒、避孕等作用，其良好的療效被眾多的制藥工業(yè)應(yīng)用，是云南白藥、宮血寧、熱毒清等重要中成藥的主要成分，用途極為廣泛[3-5]。

由于近年重樓藥材供需矛盾突出，七葉一枝花已被列為國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材瀕危物種[6-7]。因此，積極開展七葉一枝花組織培養(yǎng)是解決當(dāng)前重樓藥材嚴(yán)重短缺和更好地保護(hù)其野生植物資源的有效方法。然而到目前為止，關(guān)于七葉一枝花植物的組織培養(yǎng)還未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展[8-12]。本研究以福建七葉一枝花的小苗、根、帶柄葉為外植體，開展組織培養(yǎng)工作，以期利用組織培養(yǎng)技術(shù)有效解決福建七葉一枝花種苗繁育的瓶頸問題，為生產(chǎn)七葉一枝花植物次生代謝產(chǎn)物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

七葉一枝花采自福建省三明市沙縣大佑山，海拔900 m，在2—3月，取1 a生的整株植株帶土挖取，置于自封袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。重樓皂苷含量檢測(cè)采取七葉一枝花組培苗組培過程中，產(chǎn)生的愈傷組織、根系和塊莖。

重樓皂苷Ⅰ對(duì)照品(111590-201604)、重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌?111591-201604)、重樓皂苷Ⅵ對(duì)照品(111592-201604)、重樓皂苷Ⅶ對(duì)照品(111593-201604)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純；水為雙蒸水。其他試劑均為分析純。Waters 2695高效液相色譜儀；WND200型粉碎機(jī)；EX1252H電子天平。

1.2 方法

1.2.1 七葉一枝花外植體消毒和誘導(dǎo)

選取七葉一枝花的整株小苗、根、帶柄葉為外植體。在超凈工作臺(tái)上先將各外植體經(jīng)70%乙醇消毒30 s，再用0.1%升汞溶液消毒6～8 min，無菌水沖洗待用；將消毒完成的外植體接種于1/2MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1培養(yǎng)基。不同類型的外植體各接種60個(gè)，20個(gè)為1個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次。每個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)80 d，有長(zhǎng)出愈傷組織、隱芽的外植體，屬誘導(dǎo)成功，并換算誘導(dǎo)率。外植體誘導(dǎo)率=100%×產(chǎn)生愈傷、隱芽的外植體數(shù)/接入外植體總數(shù)。

1.2.2 七葉一枝花增殖分化與生根培養(yǎng)

將長(zhǎng)出的愈傷組織、側(cè)芽接入分化培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IAA1.0 mg·L-1中培養(yǎng)。分化出小苗，既切下轉(zhuǎn)接生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.3 mg·L-1中培養(yǎng)。未分化的繼續(xù)增殖分化培養(yǎng)。待有足夠的增殖數(shù)量后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。轉(zhuǎn)接時(shí)1瓶接4塊，稱重，轉(zhuǎn)接60 d后，統(tǒng)計(jì)增殖率、絕對(duì)生長(zhǎng)速率和相對(duì)生長(zhǎng)速率。以上處理5瓶為1個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次。

以上培養(yǎng)條件為溫度(20±2)℃，光照時(shí)間12 h·d-1，光照度1 000～1 500 lx。

1.2.3 重樓皂苷含量測(cè)定

參照2015版《中國(guó)藥典》測(cè)重樓皂苷的方法[1]，對(duì)七葉一枝花組培的塊莖芽、根系、生根苗，進(jìn)行重樓皂苷含量的測(cè)定。色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm；柱溫25 ℃；流速為0.8 mL·min-1。

表1 梯度洗脫程序

對(duì)照品溶液的制備。分別精密稱取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對(duì)照品適量，置25 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL中含重樓皂苷1、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ分別為0.366 7、0.338 3、0.345 6、0.326 7 mg的混合溶液，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備。取組織培養(yǎng)過程中的根、塊莖、愈傷組織適量，粉碎成末(過3號(hào)篩)，每份精密稱定0.5 g，重復(fù)3次。置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，冷卻后再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

1.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4，0.5 mL，置1.5 mL的進(jìn)樣量瓶中，加甲醇至1 mL，即得每1 mL中含重樓皂苷Ⅰ分別為0.036 67～0.183 3 mg，重樓皂苷Ⅱ分別為0.033 83～0.169 2 mg，重樓皂苷Ⅵ分別為0.034 56～0.172 8 mg，重樓皂苷Ⅶ分別為0.032 67～0.163 4 mg的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度(x，mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.2.5 樣品測(cè)定

按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄液相色譜圖，并計(jì)算平均含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型外植體的誘導(dǎo)情況

外植體在消毒接種3 d后部分出現(xiàn)污染。消毒成功的小苗15 d后在塊莖部位出現(xiàn)不同程度的膨大，30 d后葉片枯萎，現(xiàn)出隱芽和愈傷組織。根系和帶柄葉接種后，60 d后在斷口處長(zhǎng)出愈傷組織(圖1)。

a—小苗消毒接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基；b—小苗葉片枯萎，塊莖膨大，現(xiàn)出側(cè)芽；c—根部斷口膨大長(zhǎng)出愈傷組織；d—葉柄斷口膨大長(zhǎng)出愈傷組織。

從表2可以看出，采用乙醇加升汞的方法能有效殺死外植體的菌類。根部染菌率最低，為10%；帶柄葉染菌率最高，為50%，因此，可適當(dāng)增加消毒時(shí)間降低帶柄葉的污染。不同外植體類型，通過誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1/2MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1，能成功誘導(dǎo)出愈傷或隱芽，但不同外植體類型誘導(dǎo)率差異明顯。以小苗誘導(dǎo)率顯著最高，為58.33%，根和帶柄葉誘導(dǎo)率差異不明顯。因此，福建七葉一枝花組織培養(yǎng)的外植體建議采用小苗。

表2 不同類型外植體對(duì)七葉一枝花組培誘導(dǎo)的影響

2.2 增殖與生根

由圖2可知，將誘導(dǎo)出的愈傷組織、側(cè)芽轉(zhuǎn)接分化培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1培養(yǎng)，能完成正常的增殖和分化過程；將分化的小苗轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.3 mg·L-1中，則小苗塊莖變粗壯，并產(chǎn)生大量根系。

a—叢生芽增殖；b—叢生芽分化成小苗；c—愈傷組織增殖與分化成芽；d—分化苗生根。

從表3中可以看出，不同增殖途徑對(duì)組培影響很大。叢生芽途徑的絕對(duì)生長(zhǎng)速率、相對(duì)生長(zhǎng)速率、增殖率均顯著低于愈傷組織途徑。不同增殖途徑不影響小苗的生根，因此，福建七葉一枝花組織培養(yǎng)建議采用愈傷組織途徑。

表3 不同組培途徑對(duì)增殖的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

按2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣，得到如圖3的重樓混合對(duì)照液的HPLC色譜圖。記錄峰面積，以質(zhì)量濃度(x，mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到如圖4的標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖4中可以看出，皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的R2值分別為0.998 9、0.997 2、0.997、0.997 8，表明線性條件良好，可作測(cè)量樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線來使用。

1—重樓皂苷Ⅶ；2—重樓皂苷VI；3—重樓皂苷Ⅱ；4—重樓皂苷Ⅰ。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 不同組培產(chǎn)物的皂苷含量分析

七葉一枝花的主效成分為甾體皂苷。從表4和圖5可以得出，組培過程中，福建七葉一枝花產(chǎn)生的根、塊莖、愈傷組織均含有重樓皂苷成分，根部的總皂苷含量達(dá)0.342%，愈傷組織達(dá)0.339%，塊莖的總皂苷含量最高，達(dá)0.497%(2015版藥典要求0.6%)。3個(gè)部位的4種皂苷成分中，以偏諾皂苷—皂苷Ⅶ占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其余3種皂苷含量極低或未檢出。

表4 組培中不同部位的皂苷含量

圖5 福建七葉一枝花組培過程中不同部位的HPLC色譜圖

3 討論

3.1 七葉一枝花組織培養(yǎng)

組培快速繁殖技術(shù)是解決七葉一枝花種苗問題的重要途徑。本文在對(duì)七葉一枝花組培的過程中發(fā)現(xiàn)，在適宜時(shí)期選擇有效外植體部位非常重要。本研究中所采用的小苗、根、帶柄葉為外植體，均能成功誘導(dǎo)出愈傷或隱芽，但不同外植體類型誘導(dǎo)率差異明顯。以小苗誘導(dǎo)率顯著最高，為58.33%，而且產(chǎn)生的愈傷組織和叢生芽數(shù)量也更多，生長(zhǎng)質(zhì)量也更好，因而也確保了后繼的成功增殖。本研究也曾采用了除第一節(jié)根莖以外的其他根莖作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，但最終都未獲得愈傷組織，這與胡天印等[11-12]的研究結(jié)果相似。因此，七葉一枝花頂芽保持有較強(qiáng)的潛在分裂能力，細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后較易脫分化產(chǎn)生愈傷組織或叢生芽，而本文采用沒有傷口的整株小苗，既能減少頂芽在消毒時(shí)受到傷害，又能為頂芽塊莖生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，只是如何加快愈傷組織或叢生芽的誘導(dǎo)速率、正確引導(dǎo)愈傷組織或叢生芽快速增殖，是建立福建七葉一枝花組織培養(yǎng)體系的關(guān)鍵。

3.2 七葉一枝花組培生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物

李恒[8]在重樓屬植物的書中提到，重樓愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，檢測(cè)出不含重樓皂苷。本研究重樓皂苷作為七葉一枝花植物中的最主要的有效成分，屬于植物的次生代謝產(chǎn)物。經(jīng)多次繼代培養(yǎng)的福建七葉一枝花叢生芽和愈傷組織，是可以在產(chǎn)生大量初生代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步產(chǎn)生重樓皂苷次生代謝物。因此，通過組織培養(yǎng)生產(chǎn)重樓次生代謝產(chǎn)物是一種可行的、具有應(yīng)用潛力的生物技術(shù)途徑。在七葉一枝花植物以后的組織培養(yǎng)研究過程中，是否可通過改變培養(yǎng)基中各成分的種類、比例，提高愈傷組織的增殖率和皂苷含量還有待進(jìn)一步研究。

本研究以福建七葉一枝花的小苗、根、帶柄葉為外植體，開展組織培養(yǎng)和皂苷含量測(cè)定研究，初步建立了福建七葉一枝花組織培養(yǎng)體系，證實(shí)了通過組織培養(yǎng)獲得重樓皂苷次生代謝物的可行性，為繁殖福建七葉一枝花種苗提供新途徑，同時(shí)也為生產(chǎn)七葉一枝花植物次生代謝產(chǎn)物奠定了工作基礎(chǔ)。