大豆北方莖潰瘍病菌熒光RAA檢測(cè)方法的建立

陳吳健，范宇博，嚴(yán)穎鵬，林曉佳，任琰，吳志毅，程帆，郭利川，應(yīng)清界

(1.杭州海關(guān)技術(shù)中心，浙江 杭州 310016；2.江蘇奇天基因生物科技有限公司，江蘇 無錫 214000)

大豆莖潰瘍病是由大豆莖潰瘍病菌感染大豆所引起的疾病，大豆莖潰瘍病分大豆北方莖潰瘍病和大豆南方莖潰瘍病，其病原體分別為大豆北方莖潰瘍病菌(Diaporthephaseolorumvar.caulivora，DPC)和大豆南方莖潰瘍病菌(Diaporthephaseolorumvar.meridionalis，DPM)，DPC屬子囊菌門、球殼目、間座殼科、間座殼屬。該病菌侵染植株后迅速發(fā)展形成莖桿環(huán)狀損傷，并可導(dǎo)致正在生長(zhǎng)的植株死亡。發(fā)病嚴(yán)重的田塊有80%的植株受到侵染，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在美國(guó)、阿根廷、巴西、加拿大、巴拉圭、意大利、前南斯拉夫、克羅地亞等歐洲部分國(guó)家及地區(qū)有發(fā)生報(bào)道，是國(guó)外大豆生產(chǎn)上的重要病害[1]。

2005年，我國(guó)首次從美國(guó)進(jìn)境大豆發(fā)現(xiàn)有大豆北方莖潰瘍病菌[2]，進(jìn)境大豆攜帶大量的豆桿、豆莢及其他雜質(zhì)，帶菌的可能性很大。在進(jìn)境大豆的運(yùn)輸、加工、下腳料的處理過程中都有傳播擴(kuò)散的可能，一旦傳入將對(duì)我國(guó)大豆生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。由于傳入風(fēng)險(xiǎn)高，我國(guó)絕大部分地區(qū)都適合該病菌生長(zhǎng)[3]，因此，被我國(guó)列為檢疫性有害生物，由此亟需一種快速簡(jiǎn)便的方法應(yīng)對(duì)口岸進(jìn)出糧谷的檢測(cè)。

重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增(recombinase aid amplification，RAA)是一種新的在恒溫下可以快速擴(kuò)增核酸的技術(shù)，RAA擴(kuò)增法采用來自于大腸桿菌的recA重組酶，利用其在常溫下可以與DNA緊密結(jié)合的特性，并結(jié)合引物形成聚合體掃描雙鏈DNA，在與引物同源的序列處使雙鏈DNA解旋。在單鏈結(jié)合蛋白(SSB)和DNA聚合酶的作用下，新的DNA片段可以在體外快速地?cái)U(kuò)增出來。這個(gè)體外DNA擴(kuò)增的過程不需要高溫，一般在37 ℃或者室溫下反應(yīng)15～30 min即可得到與傳統(tǒng)高溫PCR相同的目的片段[4]。

本研究建立了大豆北方莖潰瘍病的熒光RAA檢測(cè)方法，并對(duì)方法的特異性、靈敏度及對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。為我國(guó)進(jìn)口大豆的DPC檢測(cè)提供了一種靈敏、精準(zhǔn)、簡(jiǎn)便的新方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

取大豆常見病害及其近似菌株進(jìn)行試驗(yàn)，驗(yàn)證引物的特異性。供試菌株均為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定(表1)。

表1 供試菌株基本情況

1.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得大豆北方莖潰瘍病菌基因組序列，選擇大豆北方莖潰瘍病菌的特異性保守基因作為目標(biāo)檢測(cè)基因，并進(jìn)行多序列比對(duì)，從中選出一段保守序列，根據(jù)序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成DNA質(zhì)粒，質(zhì)粒大小298 bp；為了方便進(jìn)行靈敏度測(cè)定，將由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的大豆北方莖潰瘍病菌DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，37 ℃培養(yǎng)8 h，采用商品化的質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行大豆莖潰瘍病菌DNA質(zhì)粒提取，經(jīng)濃度測(cè)定后將其濃度稀釋至1010μL-1備用。

1.3 特異性引物、探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)RAA技術(shù)引物和探針設(shè)計(jì)原則，通過篩選和評(píng)價(jià)，設(shè)計(jì)的熒光探針修飾在探針中間，熒光報(bào)告基團(tuán)修飾在離5′端堿基數(shù)32 bp的位置上，淬滅基團(tuán)修飾在離3′端堿基數(shù)15 bp的位置上，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間間隔2個(gè)堿基位置，其中1個(gè)堿基用于修飾四氫呋喃殘基。

1.4 主要設(shè)備和試劑

RAA基礎(chǔ)熒光通用反應(yīng)試劑(含重組酶等凍干粉)；反應(yīng)緩沖液(450 mmol Tris-HCl Buffer，260 mmol MgAc，10%m/VPEG 10 000)由江蘇奇天基因科技有限公司提供；探針與引物混合物(探針0.02 mmol，引物0.05 mmol)；核酸提取試劑盒為QIAGEN DNeasy Plant Mini kit；RAA-F1620熒光檢測(cè)儀(奇天基因)。

1.5 DNA的提取

供試菌株在PDA上培養(yǎng)后，刮取菌絲，液氮研磨后取0.1～0.2 g。大豆用萊馳MM400球磨儀充分粉碎，取0.1～0.2 g，用核酸試劑盒提取DNA。

1.6 特異性驗(yàn)證

取8個(gè)反應(yīng)管，吸取27 μL反應(yīng)緩沖液，加入2 μL探針與引物的混合物，充分混勻；將混勻后的緩沖液加入到RAA基礎(chǔ)熒光通用反應(yīng)試劑管中，使凍干粉充分溶解并混勻；在8個(gè)配制好的管中分別依次加入1 μL陰性質(zhì)控品、大豆北方莖潰瘍病菌樣本、大豆南方莖潰瘍病菌樣本、大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌、大豆鐮刀菌、大豆莖莢枯腐病菌、大豆紫斑病菌、大豆炭疽病菌DNA各1 μL為模板，每個(gè)反應(yīng)管進(jìn)行充分混勻，每個(gè)反應(yīng)管總體積為50 μL；將混勻的反應(yīng)管放入RAA-F1620熒光檢測(cè)儀中，在39 ℃反應(yīng)20 min。

1.7 靈敏度檢測(cè)

將5 μL 1010mL-1大豆莖潰瘍病菌DNA質(zhì)粒制成10倍梯度的工作標(biāo)準(zhǔn)品1～6，濃度分別為：1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102mL-1；吸取376 μL反應(yīng)緩沖液，加入16 μL探針與引物的混合物，充分混勻；吸取混勻后的緩沖液49 μL試劑分別加入到7個(gè)RAA基礎(chǔ)熒光通用反應(yīng)試劑管中，使凍干粉充分溶解并混勻；在7個(gè)配制好的管中分別加入1 μL陰性質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)工作品1～6，每個(gè)反應(yīng)管進(jìn)行充分混勻，每個(gè)反應(yīng)管總體積為50 μL；將混勻的反應(yīng)管放入RAA-F1620熒光檢測(cè)儀中，在39 ℃反應(yīng)20 min。

1.8 大豆樣品的檢測(cè)

取8個(gè)反應(yīng)管，分別按如下操作，吸取27 μL反應(yīng)緩沖液，加入2 μL探針與引物的混合物，充分混勻；將混勻后的緩沖液49 μL試劑加入到RAA基礎(chǔ)熒光通用反應(yīng)試劑管中，使凍干粉充分溶解并混勻；在8個(gè)配制好的管中分別加入1 μL陰性質(zhì)控品、經(jīng)過實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的2份DPC陽性的2份美國(guó)大豆、2份阿根廷大豆、2份DPC陰性的巴西大豆的DNA，各1 μL為模板，每個(gè)反應(yīng)管進(jìn)行充分混勻，每個(gè)反應(yīng)管總體積為50 μL；將混勻的反應(yīng)管放入RAA-F1620熒光檢測(cè)儀中，在39 ℃反應(yīng)20 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針

上游引物序列5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAG GAAGGTTAGTG-3′；

下游引物序列5′-GCGACGGCAGGTGTGGTAA GAGTGGTGGCGGAAATG-3′；

探針序列及修飾方法為5′-CAGCTGTCTGCGTG CGGCCATTTGCGCCGCA/i6FAMdT//C THF//iBHQdT CACACCTGGAGGCG-3′。

其中，F(xiàn)AM為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQ為熒光淬滅基團(tuán)，THF為四氫呋喃殘基，修飾方法為FAM：6-Carboxyfluorescein；THF：tetrahydrofuran；BHQ：black hole quencher；phosphate：3′ phosphate to block elongation。

2.2 特異性檢測(cè)

用表1中的菌株對(duì)設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行特異性檢測(cè)。結(jié)果顯示，只有大豆北方莖潰瘍病菌樣本DNA明顯有擴(kuò)增，其他樣本及陰性質(zhì)控品均沒有擴(kuò)增，均為陰性(圖1)。結(jié)果表明，本方法特異性好，可以區(qū)分大豆北方莖潰瘍病菌的近似種及大豆上常見的病害。

圖1 特異性的檢測(cè)結(jié)果

2.3 靈敏度檢測(cè)

將大豆莖潰瘍病菌DNA質(zhì)粒制成10倍梯度的工作標(biāo)準(zhǔn)品1～6，用于實(shí)時(shí)熒光RAA檢測(cè)，最快2 min就有明顯擴(kuò)增，10 min內(nèi)所有標(biāo)準(zhǔn)工作品均有擴(kuò)增(圖2)。根據(jù)當(dāng)熒光增加量為熒光起始量的30%為陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明，該檢測(cè)方法的檢測(cè)靈敏度達(dá)到1.0×103mL-1。

圖2 靈敏度的檢測(cè)結(jié)果

2.4 大豆樣品的檢測(cè)

實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表明，陽性對(duì)照和美國(guó)、阿根廷大豆可見陽性擴(kuò)增曲線，巴西大豆和陰性對(duì)照無擴(kuò)增信號(hào)，說明該方法不但可以用來鑒定大豆北方莖潰瘍病菌菌株，同時(shí)也可以用于檢測(cè)進(jìn)出境大豆產(chǎn)品中是否攜帶的大豆北方莖潰瘍病菌，且靈敏度和精確度和實(shí)時(shí)熒光PCR相當(dāng)(圖3)。

圖3 大豆樣品的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

大豆(Glycinemax)是我國(guó)重要的油料作物和糧食作物，也是世界上食用油和植物蛋白的主要來源，在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。目前我國(guó)大豆產(chǎn)量居世界第4位，但仍然不能滿足國(guó)內(nèi)植物油及飼料蛋白加工的需要。隨著我國(guó)進(jìn)口大豆的數(shù)量逐年遞增，各種危害大豆生產(chǎn)的病害傳入的風(fēng)險(xiǎn)也逐漸增大。

大豆北方莖潰瘍病菌于1950年在美國(guó)愛荷華州首次發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重危害世界大豆主產(chǎn)區(qū)的大豆生產(chǎn)，可以通過種子和混在大豆中的病殘?bào)w遠(yuǎn)距離傳播[5]。北方莖潰瘍菌的種子侵染率可達(dá)10%～20%，因此，隨大豆傳入的可能性極高；深圳、寧波、浙江等口岸曾多次從美國(guó)、阿根廷進(jìn)口的貿(mào)易大豆中截獲到大豆北方莖潰瘍病菌[6]。為了保護(hù)我國(guó)的大豆產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，我國(guó)將大豆莖潰瘍病菌列入進(jìn)境檢疫性有害生物名錄，用檢疫方法嚴(yán)防其傳入。

目前，檢測(cè)大豆北方莖潰瘍病的方法主要有分離培養(yǎng)法、PCR法、LAMP法等[7-8]。傳統(tǒng)方法如分離培養(yǎng)技術(shù)耗時(shí)較長(zhǎng)，操作繁瑣；采用PCR技術(shù)，雖然結(jié)果精確度高，需昂貴儀器，裝備精良的實(shí)驗(yàn)室和專業(yè)的操作人員。LAMP法不需要昂貴的PCR儀，等溫靈敏、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單且易于觀察，但是LAMP技術(shù)要求多對(duì)引物，且對(duì)靶基因的要求較高，假陽性高，不利于在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用。本研究首次建立了大豆北方莖潰瘍病菌的RAA檢測(cè)方法，克服了以上技術(shù)的缺點(diǎn)，并通過樣品的驗(yàn)證表明，該方法方便快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)，能夠檢測(cè)到1.0×103mL-1的DNA樣本，整個(gè)檢測(cè)過程為5～20 min，能夠滿足進(jìn)出境大豆及大豆產(chǎn)品快速通關(guān)的要求。