濱海鹽堿地根際溶磷細(xì)菌磷素轉(zhuǎn)化特征

劉 萍, 夏江寶

1 濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院, 濱州 256600 2 山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 濱州 256600

黃河三角洲鹽堿地土地資源豐富,而土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化是鹽堿地植被生長(zhǎng)及其生產(chǎn)力的主要限制因素之一[1],其中,磷素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的主要養(yǎng)分之一[2- 4],主要存在于植物的核酸及細(xì)胞膜磷脂等,并通過(guò)植物的一系列生理活動(dòng)促進(jìn)作物生長(zhǎng)[5]。植物中的磷主要從土壤中獲取,其含量約為干重的0.2%。據(jù)研究,鹽堿地磷庫(kù)源相對(duì)豐富,但是可用于生物合成的磷不僅僅取決于土壤中磷庫(kù)總量,還取決于其溶解度,而溶解度又取決于土壤中磷的化學(xué)反應(yīng)和生物相互作用[6- 7]。由于鹽漬土壤含有較多的堿性物質(zhì),致使部分磷素庫(kù)源不能被植物直接吸收利用,而是被固化形成難溶性的磷酸鈣鹽；同時(shí),土壤中的金屬離子,包括Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等物質(zhì),同樣可與磷元素形成難溶性磷酸鹽,這部分不能被植物體直接吸收的磷庫(kù)源,稱(chēng)為無(wú)效態(tài)磷[8]。因此,如何將無(wú)效態(tài)磷轉(zhuǎn)化為有效態(tài)磷,提高土壤有效磷含量,這一問(wèn)題越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外諸多科研工作者的關(guān)注,也是本研究的主要目的。

探明鹽堿地生境中土壤肥力的提升途徑與機(jī)制,尤其是有效磷含量的提高途徑,對(duì)提高鹽堿地土地利用及植被種類(lèi)和生物量,具有較大意義[9]。植物根際微生物種類(lèi)和數(shù)量較豐富,與植物共存形成了根際圈微生物群落,對(duì)植物的生長(zhǎng)、抗病性及生物產(chǎn)量提高等多方面具有積極的意義[10- 13]。其中溶磷微生物 (phosphate solubilizing microorganisms,PSM)是土壤微生物的主要類(lèi)群之一,同時(shí)也是根際微生物的重要組成部分[14],能將難溶性的磷酸鹽如礦磷粉轉(zhuǎn)化成為植物可吸收利用的磷素,對(duì)提高土壤有效磷含量、緩解植物鹽堿脅迫損傷及改良鹽堿土具有積極作用[8]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃河三角洲濱海鹽堿地典型鹽生植物堿蓬根際土壤溶磷微生物進(jìn)行了研究。采用改良的PKO培養(yǎng)基,共篩選出17株溶磷菌。通過(guò)復(fù)篩,得到一株溶磷效果較好的耐鹽堿溶磷細(xì)菌,對(duì)其溶磷能力進(jìn)行了研究,希望能為改良鹽堿地、提升土壤肥力提供一點(diǎn)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株

從黃河三角洲鹽地堿蓬根際土壤中篩選了一株溶磷細(xì)菌,其編號(hào)為RPB03。菌落粘稠,中間隆起,邊緣光滑,呈淡黃色,革蘭氏染色陰性。

1.1.2培養(yǎng)基

溶磷微生物初次分離采用改良的PKO培養(yǎng)基[15- 16],液體菌種培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基,溶磷能力研究以PKO培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl5.0 g、水1000 mL,用NaOH調(diào)pH7.4—7.6。

改良PKO培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g、Ca3(PO4)25.0 g、(NH4)2SO40.50 g、NaCl 0.20 g、KCl 0.20 g、MgSO40.03 g、MnSO40.03 g、FeSO40.03 g、蒸餾水1000 mL。pH8.0—8.2。

1.1.3儀器和試劑

恒溫?fù)u床,超凈工作臺(tái),光照培養(yǎng)箱,紫外分光光度計(jì),GTR10- 1型高速冷凍離心機(jī)。試驗(yàn)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1土樣采集及溶磷微生物分離與純化

采集黃河三角洲鹽地堿蓬根際土壤置入無(wú)菌袋內(nèi),帶回實(shí)驗(yàn)室。采用涂布平板法進(jìn)行微生物分離培養(yǎng),純化后,接種于PKO培養(yǎng)基培養(yǎng)12 d,觀察平板,記錄菌落直徑及溶磷圈直徑,并計(jì)算溶磷系數(shù)。

溶磷系數(shù)=H/C(H表示溶磷圈直徑,C表示菌落直徑)。

1.2.2溶磷動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定

將RPB03菌株活化后,接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)24h。用無(wú)菌接種環(huán)取一環(huán)接入200 mL PKO液體培養(yǎng)基中混勻,置于30℃搖床培養(yǎng)。分別在0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d及6 d吸取培養(yǎng)液,用鉬銻比色法測(cè)定溶液中有效磷含量[17],用分光光度法在600nm下測(cè)定菌體細(xì)胞吸光度值。

1.2.3培養(yǎng)條件

將保存的菌種RPB03活化,液體培養(yǎng)36 h,離心取菌體,洗滌后用PKO液體培養(yǎng)基活化,取1 mL(含菌量為108菌落數(shù)/mL)的種子液轉(zhuǎn)接入PKO培養(yǎng)基,按照下列條件進(jìn)行搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后,10000 rpm/min離心15 min,濾液過(guò)0.22 μm微孔濾膜后,測(cè)定有效磷含量。

pH值設(shè)置6、7、8、9 和 10；溫度設(shè)置10℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃；轉(zhuǎn)速設(shè)置為50、90、130、170和210 rpm/min；鹽濃度設(shè)置分別為0%、1%、2.5%、5%、7.5%和 10%；碳源分別用麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖和葡萄糖作碳源；氮源分別為硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、尿素、氯化銨。碳源和氮源添加量分別是10 g和0.5 g。

1.2.4菌株RPB03對(duì)鹽漬土壤磷素轉(zhuǎn)化效果

供試土壤類(lèi)型為鹽堿化潮土母質(zhì)土壤,土壤理化性狀：全磷0.530 g/kg、全鉀0.943 g/kg、堿解氮0.086 g/kg、速效磷0.029 g/kg,pH 8.0,含鹽量0.34%。

(1)對(duì)裸斑鹽漬土壤磷素轉(zhuǎn)化效果

取兩份等量的黃河三角洲鹽堿土,分為控制組和實(shí)驗(yàn)組,控制組土壤采用干熱滅菌法進(jìn)行土壤滅菌,用烘箱170℃烘干2 h,實(shí)驗(yàn)組土壤不做任何處理。兩份土壤分別置于經(jīng)無(wú)菌處理的花盆內(nèi),將培養(yǎng)36 h的RPB03細(xì)菌細(xì)胞施入花盆,在處理第0天、30天、60天 取土樣測(cè)定土壤中有效磷含量。

(2)對(duì)有植被鹽漬土壤磷素轉(zhuǎn)化效果

將鹽堿土混合少量氮鉀肥,分裝花盆。處理組施加RPB03菌劑,對(duì)照組(CK)添加等量水。處理120 d后,測(cè)試中華結(jié)縷草(ZoysiasinicaHance)生物量以及土壤中有效磷含量。

1.2.5菌株鑒定

將純化的細(xì)菌菌株斜面提交上海生物工程有限公司,由其進(jìn)行16SrRNA序列測(cè)定,將獲得的序列輸入GenBank,用Blast 程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較分析,利用 MEGA7 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.6統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽地堿蓬根際解磷微生物解析

2.1.1鹽地堿蓬根際土壤中溶磷微生物種類(lèi)

從鹽地堿蓬根際土壤中共分離17株溶磷菌,其中真菌2株,放線菌2株,細(xì)菌13株,其溶磷效果見(jiàn)表1。依據(jù)溶磷菌對(duì)磷酸鈣的溶解能力,發(fā)現(xiàn)RPB03在生長(zhǎng)繁殖及溶磷能力方面,效果比較優(yōu)良,故對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

表1 堿蓬根際溶磷微生物

2.1.2菌株RPB03溶磷動(dòng)力學(xué)

為了更準(zhǔn)確地測(cè)試RPB03菌株的溶磷能力,對(duì)該菌株進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)研究(圖1)。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),培養(yǎng)液中可溶性磷含量呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(shì),而菌體細(xì)胞量基本呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢(shì)。在測(cè)試0—2d內(nèi),菌體的生長(zhǎng)與溶液中可溶性磷含量趨勢(shì)保持一致,皆呈現(xiàn)上升趨勢(shì),在培養(yǎng)第2天有效磷含量達(dá)到最大,為318.45 mg/L；在此之后至第4天,隨著菌體細(xì)胞呈現(xiàn)持續(xù)生長(zhǎng)趨勢(shì),其可溶性磷含量持續(xù)下降,至第5天時(shí)降至最低,為60.11 mg/L；與此同時(shí),菌體的生長(zhǎng)也有所減緩；第6天可溶性磷含量有所提高,而菌體細(xì)胞生長(zhǎng)量也達(dá)到最大量。根據(jù)動(dòng)力學(xué)曲線,可將該菌的溶磷能力測(cè)試時(shí)間設(shè)置為48h。在0—48h之間,其磷素轉(zhuǎn)化能力與微生物細(xì)胞生物量之間相關(guān)性很大,其相關(guān)系數(shù)R值為0.9486。但隨著RPB03菌株生物量的增大,其溶液磷含量與菌體量之間卻呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性,可見(jiàn)隨著微生物生物量的增加,細(xì)胞對(duì)溶液中可溶性磷的溶解作用大于吸收作用,隨著微生物菌體數(shù)量的不斷增加,對(duì)磷素的需求急速提升,從而造成后期溶液磷素含量的下降。

圖1 RPB03菌株溶磷動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 The dissolved phophorus kinetic curve of strain RPB03不同小寫(xiě)字母表示溶磷菌株在不同處理時(shí)間內(nèi)溶磷能力差異顯著(P<0.05)

2.2 密閉培養(yǎng)條件下,不同環(huán)境因子對(duì)RPB03菌株溶磷能力的影響

2.2.1不同酸堿度對(duì)RPB03菌株磷素轉(zhuǎn)化效果

隨溶液初始pH值的升高,RPB03菌株溶磷能力不斷下降,當(dāng)pH>8條件下溶磷效果存在顯著差異(圖2)。pH6—8范圍內(nèi)其溶磷能力無(wú)差異,皆超過(guò)430 mg/L,初始pH6時(shí)RPB03溶磷效果最好,達(dá)到450.57 mg/L。當(dāng)pH提高到9時(shí),其溶磷能力有所降低,下降至385.19 mg/L,當(dāng)pH提高至10時(shí),仍然具有一定的溶磷能力(175.13 mg/L)?？梢?jiàn),該菌株從微酸性至堿性的范圍內(nèi)皆有溶磷能力,并且在較強(qiáng)的堿性環(huán)境條件下,仍然可以通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)境酸堿度進(jìn)行磷的轉(zhuǎn)化。黃河三角洲土壤呈弱堿性[1- 2],pH值在8左右,從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推測(cè),該菌能夠很好的適應(yīng)該地區(qū)的土壤堿度。

圖2 不同pH值對(duì)RPB03菌株溶磷能力的影響 Fig.2 Effect on the soluble phosphorus ability of RPB03 strain under different pH value不同小寫(xiě)字母表示溶磷菌株在不同處理組間溶磷能力差異顯著(P<0.05)

培養(yǎng)48h后,各處理溶液pH值皆低于7,甚至有處理組(pH=8)低至4.21。溶磷能力與終點(diǎn)pH值相關(guān)系數(shù)R值為-0.9508。

2.2.2不同溫度條件下對(duì)RPB03菌株磷素轉(zhuǎn)化影響

溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖及新陳代謝的一個(gè)重要因子。不同溫度條件下RPB03溶磷效果存在顯著差異(圖3),溫度為35℃時(shí),有效磷含量達(dá)到最高,為446.70 mg/L,其次是30℃。溫度降低至10℃時(shí),有效磷含量?jī)H為52.57 mg/L,可能是低溫限制了細(xì)菌正常的生長(zhǎng)繁殖,導(dǎo)致溶磷效果較差；當(dāng)溫度高達(dá)45℃時(shí),其具有相對(duì)較高的溶磷能力(有效磷含量為119.52 mg/L)。野外地面溫度一般不超過(guò)45℃,推測(cè)該菌施入土壤后,能夠適應(yīng)其溫度的變化范圍。培養(yǎng)48h后,各處理溶液pH值與溶磷能力之間仍然存在顯著的負(fù)相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)R值為-0.9718。

圖3 不同溫度對(duì)RPB03溶磷能力的影響 Fig.3 Effect of PRB03 strain on the soluble phosphorus ability at different temprature 不同小寫(xiě)字母表示溶磷菌株在不同處理組間溶磷能力差異顯著(P<0.05)

2.2.3不同轉(zhuǎn)速對(duì)RPB03菌株磷素轉(zhuǎn)化效果

不同的轉(zhuǎn)速條件下,培養(yǎng)液中的溶氧量不同,轉(zhuǎn)速越高,培養(yǎng)液中溶氧量越高。隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高,RPB03菌株溶磷能力有所提高(圖4),當(dāng)轉(zhuǎn)速高于170 rpm/min時(shí),其培養(yǎng)液中有效磷含量明顯高于較低轉(zhuǎn)速的含量?？傮w來(lái)看,具有較低終點(diǎn)pH值的處理組其有效磷含量也相對(duì)較高,但其溶磷能力與終點(diǎn)pH值相關(guān)性較差,其相關(guān)系數(shù)R值為-0.2640,如50 rpm/min處理組,其終點(diǎn)pH值為5.2,低于170 rpm/min處理組,但其磷素轉(zhuǎn)化能力僅為168.93 mg/L。推測(cè)RPB03菌株在較低的溶解氧條件下,菌細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,也可能由于氧含量較低導(dǎo)致細(xì)菌代謝方面發(fā)生了變化,進(jìn)而影響其酸溶磷素的能力。很多研究結(jié)果表明,溶磷菌溶磷能力與產(chǎn)酸能力并不呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致的。

圖4 不同轉(zhuǎn)速對(duì)RPB03菌株溶磷能力的影響 Fig.4 Effect of PRB03 strain on the soluble phosphorus ability at different rotational speed不同小寫(xiě)字母表示溶磷菌株在不同處理組間溶磷能力差異顯著(P<0.05)

2.2.4不同鹽度對(duì)RPB03菌株磷素轉(zhuǎn)化效果

不同NaCl鹽度條件下,RPB03菌株溶磷能力存在顯著差異(圖5)。隨鹽度增加,溶磷能力呈下降趨勢(shì),但在5%鹽度下,RPB03菌株溶磷能力呈現(xiàn)一個(gè)跳躍的高峰,與無(wú)鹽條件下磷素轉(zhuǎn)化能力相比較,兩者未達(dá)到差異顯著水平。為什么在鹽度5%條件下再次出現(xiàn)峰值呢？筆者認(rèn)為,微生物對(duì)鹽度的耐受能力可能存在一個(gè)敏感范圍,5%的鹽度范圍可能正好是處于該菌的鹽度敏感區(qū)間,在敏感鹽度范圍內(nèi),有可能激活微生物某些基因的表達(dá)來(lái)適應(yīng)環(huán)境。但具體原因究竟如何,還需要進(jìn)一步的研究。終點(diǎn)pH值結(jié)果顯示,這兩個(gè)處理組終點(diǎn)pH值也較低。溶磷能力與終點(diǎn)pH值相關(guān)分析呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān),其相關(guān)系數(shù)R為 0.8890,推測(cè)該菌溶磷能力可能與細(xì)菌釋放的酸性物質(zhì)有關(guān)。

圖5 不同NaCl濃度度對(duì)菌株RPB03溶磷能力的影響 Fig.5 The effect of RPB03 strain on soluble phosphorus ability under different NaCl concentration不同小寫(xiě)字母表示溶磷菌株在不同處理組間溶磷能力差異顯著(P<0.05)

2.2.5不同碳源及氮源對(duì)RPB03菌株磷素轉(zhuǎn)化效果

碳源和氮源是微生物生長(zhǎng)所需的兩種必需元素。碳源及氮源的種類(lèi)及比例不同,不僅影響到微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)與繁殖,對(duì)其代謝產(chǎn)物也會(huì)產(chǎn)生很大的影響。

RPB03菌株對(duì)所試的五種碳源的利用能力不同,其溶磷效果存在顯著差異(圖6)。葡萄糖作唯一碳源時(shí)溶磷效果最好,達(dá)到500.87 mg/L,其次是蔗糖,乳糖作唯一碳源時(shí)效果最差。不同碳源溶磷能力與終點(diǎn)pH相關(guān)性不是太大,以乳糖作唯一碳源時(shí),其終點(diǎn)pH值比可溶性淀粉要低,但是其溶磷能力僅為其可溶性淀粉的79.24%,呈現(xiàn)顯著差異。而溶磷效果最好的終點(diǎn)pH值6.82,呈微酸性,明顯高于乳糖為碳源的pH值(5.16)。可見(jiàn),RPB03菌株在利用不同碳源時(shí),溶磷效果、代謝途徑會(huì)發(fā)生變化,導(dǎo)致其溶磷能力出現(xiàn)差異,而酸溶磷可能不是RPB03菌株降解礦物質(zhì)磷素的唯一途徑。溶磷能力與終點(diǎn)pH值相關(guān)系數(shù)R值為0.5308。

圖6 不同碳源條件下RPB03菌株溶磷能力 Fig.6 Soluble phosphorus ability of RPB03 strain at different carbon source 不同小寫(xiě)字母表示溶磷菌株在不同處理組間溶磷能力差異顯著(P<0.05)

利用不同氮源時(shí)RPB03菌株溶磷效果亦存在顯著差異(圖7)。其溶磷效果為KNO3>NH4NO3>(NH4)2SO4>NH4CI>urea。從氮源形態(tài)來(lái)看,硝態(tài)氮優(yōu)于銨態(tài)氮,尿素效果最差。溶磷能力與終點(diǎn)pH值相關(guān)性不高,其相關(guān)系數(shù)R值為-0.6287。

圖7 不同氮源下RPB03菌株的溶磷能力 Fig.7 Soluble phosphorus ability of RPB03 strain at different nitrogen source不同小寫(xiě)字母表示溶磷菌株在不同處理組間差異顯著(P<0.05)

2.3 RPB03菌株對(duì)黃河三角洲鹽堿土壤磷素轉(zhuǎn)化效果

2.3.1RPB03菌株對(duì)裸斑鹽漬土壤的溶磷效果

為了研究該菌株對(duì)裸斑鹽堿地土壤的磷素轉(zhuǎn)化效果,設(shè)置了滅菌土壤和非滅菌土壤兩個(gè)處理實(shí)驗(yàn)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,投加RPB03菌劑后,有效磷含量明顯提高,磷素轉(zhuǎn)化效果顯著(圖8)。滅菌土壤處理組和未滅菌處理組有效磷含量由最初0.029 mg/kg分別提升至0.041 mg/kg和0.043 mg/kg。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們還發(fā)現(xiàn),黃河三角洲鹽漬土壤中的其他微生物類(lèi)群與RPB03菌株具有潛在的協(xié)同效應(yīng),但協(xié)同效果不顯著。

圖8 RPB03菌株對(duì)無(wú)植被土壤的溶磷效果 Fig.8 The effect of PRB03 strain on the phosphorus solubliziton in soil without vegetation不同小寫(xiě)字母表示溶磷菌株在不同處理組間溶磷能力差異顯著(P<0.05)

2.3.2植被存在條件下溶磷菌RPB03對(duì)鹽漬土壤的溶磷效果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該菌株在植被存在條件下對(duì)土壤肥力的提升效果,選取了中華結(jié)縷草,進(jìn)行了盆栽實(shí)驗(yàn) (表2)。中華結(jié)縷草是黃河三角洲地區(qū)常見(jiàn)的草坪草種,耐踐踏,適應(yīng)性強(qiáng)。從表中可以看出,兩個(gè)處理組土壤有效磷含量都有所提高,但提高程度不同,施加菌劑處理組顯著高于對(duì)照組。雖然對(duì)照組沒(méi)有投加溶磷細(xì)菌,但土壤本身存在溶磷微生物。在植物生長(zhǎng)過(guò)程中,由于根際分泌代謝物質(zhì),土壤溶磷細(xì)菌會(huì)在根際圈內(nèi)富集,從而在一定程度上提高了土壤有效磷含量,但其提高程度不如處理組?？梢?jiàn),該菌在植被存在條件下,同樣能夠有效轉(zhuǎn)化土壤中的無(wú)效磷,提高土壤有效磷含量。

表2 溶磷菌RPB03對(duì)中華結(jié)縷草株高、干重及土壤磷含量的影響

投加RPB03菌株處理組,不僅能夠提高土壤有效磷含量,也能夠促進(jìn)中華結(jié)縷草的生長(zhǎng)。其平均株高可達(dá)29.47 cm,與對(duì)照組相比差異顯著。宇萬(wàn)太等[7]在潮棕壤上連續(xù)進(jìn)行18年的定位試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)單使磷肥對(duì)玉米秸稈增加并不顯著,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反。除了實(shí)驗(yàn)材料的差異外,兩者的實(shí)驗(yàn)土壤截然相反。本實(shí)驗(yàn)土壤采自黃河三角洲非耕地鹽漬土壤,土壤貧瘠,有效磷含量極低,這可能是對(duì)照組植物生長(zhǎng)不良的主要原因之一。而宇萬(wàn)太等研究者采用的是農(nóng)田耕地,土壤中有效磷含量本底水平高,且磷庫(kù)源充足,磷素對(duì)植物生長(zhǎng)的影響較小。姜煥煥[7]也發(fā)現(xiàn),解磷菌可提高鹽堿地土壤酶活性與土壤微生物數(shù)量,尤其可促進(jìn)參與土壤營(yíng)養(yǎng)元素的微生物種類(lèi)的富集,全面改善鹽堿土性質(zhì),促進(jìn)了植株的生長(zhǎng)。

2.4 RPB03菌株的鑒定

經(jīng) PCR 擴(kuò)增后菌株RPB03的16SrRNA序列全長(zhǎng)為1397bp,GenBank 登錄號(hào)為MH247129,BLAST分析結(jié)果顯示該序列與泛菌屬(Pantoeasp.)的16SrRNA序列同源性最高,其中與菌株P(guān)antoeavagans(CP014129)有較高的同源性,相似度均為100%,其他菌株的相似性達(dá)到99%(圖9)。綜上,確定菌株 PRB03隸屬泛菌屬。

圖9 RPB03菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.9 Polymeric analysis of strain RPB03

3 討論

3.1 根際溶磷細(xì)菌的溶磷效果及機(jī)理

研究表明,土壤溶磷微生物多數(shù)通過(guò)分泌酸性物質(zhì)分解土壤中不溶性磷素,也有相當(dāng)一部分溶磷微生物通過(guò)胞外酶來(lái)分解環(huán)境中的有機(jī)磷,例如分泌堿性磷酸酶。Khadija Ayyaz從小麥根際分離到五株具有溶磷特性的固氮螺旋菌(Azospirillumsp.)[18],可向生境中分泌醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋(píng)果酸及琥珀酸等有機(jī)酸促進(jìn)磷素的有效轉(zhuǎn)化。本試驗(yàn)菌株RPB03在溶磷能力研究過(guò)程中,亦發(fā)現(xiàn)其溶磷效果與溶液的pH值之間呈負(fù)相關(guān),推測(cè)該菌株溶磷機(jī)理可能通過(guò)分泌酸性物質(zhì)促進(jìn)了磷酸鈣的降解,但其酸性物質(zhì)的種類(lèi)還需要進(jìn)一步研究。

據(jù)報(bào)道,溶磷菌不僅能夠有效提高土壤有效磷含量,對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病性等方面皆具有積極的意義[19- 20]。已報(bào)道的溶磷菌Bacillusmegaterium[21]、Achromobacterxylosoxidans(JCp4)、Ochrobactrumsp.[22]、Pseudomonassp.[13]等多個(gè)屬種的微生物都能夠有效促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。其促生機(jī)理主要表現(xiàn)在能夠分泌植物生長(zhǎng)素IAA(indole acetic acid)。本實(shí)驗(yàn)菌株RPB03在中華結(jié)縷草株高、干重等方面都具有促進(jìn)作用,與對(duì)照相比差異顯著,但該菌株是否通過(guò)分泌植物生長(zhǎng)素促進(jìn)了植物的生長(zhǎng)并未研究。

RPB03菌株分離自堿蓬根際,Blast比對(duì)結(jié)果顯示隸屬泛菌屬(Pantoea)。已有研究報(bào)道該屬對(duì)植物生長(zhǎng)、抗病性方面具有良好的效果[23- 24]。張麗珍自檸條植物體內(nèi)分離到一株內(nèi)生泛菌,與本研究菌株皆為Pantoeavagans[25],但其溶磷能力卻相差甚遠(yuǎn),僅為4.45 mg/L。該菌株在檸條和堿蓬的生存環(huán)境完全不同,這可能是兩者解磷能力的差異主要原因。Son[26]、Chung[27]等學(xué)者也分別從大豆根際和農(nóng)作物根際分離到溶磷泛菌,其溶磷能力分別為900 mg/L和113.7 mg/L?？梢?jiàn)泛菌屬細(xì)菌廣泛存在于多種植物根際,是構(gòu)成根際微生物的主要類(lèi)群之一。從已有的研究不難發(fā)現(xiàn),不同植物根際分離的泛菌,其溶磷能力差異較大,分析其原因,可能跟泛菌所處的生態(tài)環(huán)境及植物根系的代謝產(chǎn)物有關(guān)。本研究結(jié)果也證實(shí)了不同的因子、土壤植被情況對(duì)RPB03菌株的溶磷能力影響較大。當(dāng)然,室內(nèi)實(shí)驗(yàn)條件與自然生境存在很大差異。本研究結(jié)果也只是模擬部分因子,采用了單因素實(shí)驗(yàn),其結(jié)果與在自然條件下該菌株的解磷能力相比較,究竟存在何種差異,還需要進(jìn)一步探討。

3.2 溶磷細(xì)菌對(duì)土壤肥力提升效果

黃河三角洲是由黃河攜帶大量泥沙在入?？谟俜e而成的新生陸地,受河流和海洋等多種動(dòng)力交互作用,該地區(qū)潛水埋深淺、礦化度高,導(dǎo)致土壤鹽漬化較重、范圍廣,成為限制黃河三角洲土地生產(chǎn)力的主要因素之一[28]。目前,我國(guó)對(duì)鹽漬土的改良多采用物理及生物手段[29- 30],利用微生物制劑改良鹽堿地的實(shí)踐研究仍然相對(duì)滯后。在黃河三角洲地區(qū),常采用不同植被模式[28]、灌水降鹽[31]及生物改良劑[32]等措施,其主要目的是降低土壤中的鹽分含量。對(duì)于利用解磷微生物提升土壤肥力的研究還相對(duì)薄弱,多停留在解磷微生物的一些基礎(chǔ)性研究[9- 10]。姜煥煥自黃河三角洲分離到一株解磷菌Providenciarettgeri[8],利用該菌與磷石膏聯(lián)合施用對(duì)鹽堿土進(jìn)行了改良,發(fā)現(xiàn)對(duì)土壤有效磷提升量增加了19.57 mg/kg。李學(xué)平等自濱海鹽堿地某蔬菜根際分離到一株高效解磷真菌,對(duì)小麥具有顯著的促生長(zhǎng)效果[9]。Singh等對(duì)溶磷真菌也進(jìn)了部分研究,能夠顯著提高小麥和玉米產(chǎn)量[33]。本研究篩選的溶磷菌RPB03菌株,得到了類(lèi)似的結(jié)果,對(duì)土壤有效磷提升量增加了14.33 mg/kg,實(shí)驗(yàn)植物的株高及植物干重增加顯著,具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的效果。當(dāng)然,在自然環(huán)境條件下,該溶磷細(xì)菌提升鹽漬土壤肥力效果、機(jī)理及措施還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過(guò)研究酸堿度、溫度、鹽度(NaCl)、轉(zhuǎn)速(充氧量)、氮源及碳源等環(huán)境因子對(duì)RPB03菌株溶磷能力影響,表明該菌溶磷能力顯著,在較高的酸堿度、鹽度及較高的溫度下,依然表現(xiàn)了良好的溶磷能力,在黃河三角洲鹽漬土壤生境中具有潛在的適應(yīng)性；同時(shí),該菌能夠顯著提高測(cè)試土壤的有效磷含量,從對(duì)黃河三角洲鹽堿地肥力提升方面來(lái)看,具有良好的開(kāi)發(fā)前景。