阿托伐他汀鈣對COPD模型大鼠肺血管重塑的影響及機制探討

何永鴻，強麗，王宋平△

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是由于接觸、吸入有害有毒顆?；驓怏w導(dǎo)致氣道和（或）肺泡異常，出現(xiàn)不可逆性氣流受限。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，2020年COPD已居全球疾病的經(jīng)濟負擔(dān)第5位［1］。氣道、肺實質(zhì)和肺血管炎癥反應(yīng)是COPD的主要特征，炎癥反應(yīng)和慢性缺氧進一步惡化會導(dǎo)致氣道和肺血管重塑、肺實質(zhì)破壞，最終進展為肺動脈高壓，這是COPD病情不斷進展，最終引起呼吸衰竭和肺源性心臟病的主要原因［2］。他汀類藥物是臨床上常用的調(diào)脂藥物，目前主要用于心血管疾病的預(yù)防和治療，但除了降脂作用外，他汀類還有抗炎、抗氧化、改善內(nèi)皮功能、調(diào)節(jié)免疫等作用［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物有助于改善COPD患者的臨床癥狀，延緩病情惡化，降低病死率［5-7］。目前關(guān)于他汀類藥物抗炎作用的基礎(chǔ)實驗研究缺乏，他汀類改善COPD患者氣道炎癥、肺血管炎癥及肺血管重構(gòu)等相關(guān)機制尚不明確。本研究旨在觀察阿托伐他汀鈣通過組蛋白脫乙酰酶-2（HDAC2）對COPD大鼠肺血管炎癥、肺血管重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康雌性SPF級SD大鼠18只，7～10周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購自西南醫(yī)科大學(xué)城北校區(qū)實驗動物中心，并于西南醫(yī)科大學(xué)忠山校區(qū)動物房進行飼養(yǎng)，環(huán)境溫度24～26℃，濕度50%，每日給予足量食物及飲水。

1.2 主要試劑與器材 阿托伐他汀鈣片（立普妥，輝瑞制藥有限公司，20 mg，國藥準(zhǔn)字H20051408）；脂多糖（Sigma公司）；中國嬌子牌香煙（焦油量11 mg，煙氣煙堿量1.1 mg，煙氣一氧化碳量12 mg，四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司）；大鼠HDAC2酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（ELK Biotechnology公司）；Western blot試劑盒（武漢恒意賽生物技術(shù)公司）；兔抗大鼠HDAC2單克隆抗體、兔抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）多克隆抗體、內(nèi)參GAPDH抗體及羊抗兔二抗（Aspen公司）；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（ELK Biotechnology公司）；蘇木素染液、伊紅染液（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；維多利亞藍、苦味酸-酸性品紅（VG）染液（Aspen）；PCR儀（基因擴增儀TCXP，杭州博日科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗大鼠模型的建立 大鼠于動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表法將18只大鼠分為空白對照組、COPD組、阿托伐他汀鈣組，每組6只?？瞻讓φ战M大鼠予以正常飼養(yǎng)，COPD組和阿托伐他汀鈣組參照文獻［8-9］建立COPD大鼠模型。實驗周期共42 d，在第1、14天，大鼠經(jīng)氣道滴入脂多糖200μg，2～13 d、15～42 d予以香煙煙霧吸入，2次/d（間隔6 h），每次10支。阿托伐他汀鈣組在COPD組的基礎(chǔ)上，于第2天開始，每天煙霧吸入前30 min用阿托伐他汀鈣片灌胃治療，劑量10 mg/（kg·d）［10-11］，空白對照組、COPD組同期給予等量生理鹽水灌胃。

1.3.2 體質(zhì)量記錄 每組大鼠每日在相同環(huán)境下自由進食，3組大鼠共飼養(yǎng)6周，每2周稱1次大鼠體質(zhì)量，直至取材。

1.3.3 標(biāo)本采集及制備（1）血清采集。第43天所有大鼠使用3%戊巴比妥鈉注射液（1.5 mL/kg）進行充分麻醉，開胸后心臟取血，以3 000 r/min離心15 min后，取上層血清于-80℃冰箱保存。（2）病理標(biāo)本制備。取大鼠新鮮右肺中葉組織，一部分保存于-80℃冰箱用于基因及蛋白表達測定，另一部分用4%多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋，切片（4μm）用于HE染色及維多利亞藍+VG染色。

1.3.4 HE染色及維多利亞藍+VG染色觀察肺組織病理改變 HE染色：肺組織切片經(jīng)乙醇和二甲苯脫水、蒸餾水沖洗后，加入蘇木素染3～8 min，再經(jīng)伊紅染液染色1～3 min，再次脫水封片。維多利亞藍染色+VG染色：切片經(jīng)乙醇和二甲苯脫水，使用維多利亞藍染色0.5～2 h，使用無水乙醇分化后，苦味品紅溶液中染5 min后脫水封片。HE染色后光鏡下觀察病理改變并評價肺血管炎癥程度。炎癥評分標(biāo)準(zhǔn)：無炎性細胞浸潤（0分）；少許炎性細胞浸潤（1分）；炎性細胞浸潤較多但分布不均勻（2分）；炎性細胞浸潤多，分布均勻，但不聚集成團（3分）；大量炎性細胞浸潤并聚集成團（4分）。維多利亞藍+VG染色后，利用圖像分析軟件測定肺血管重構(gòu)指標(biāo)：400倍高倍鏡下選擇50～100μm的肌性動脈（MA）進行圖像分析，計算血管壁面積/血管總面積（WA%）、血管壁厚度/血管外徑長度（WT%）。

1.3.5 ELISA檢測血清HDAC2水平 采用雙抗原夾心法，加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μL，37℃孵育2 h，加入生物素化抗大鼠HDAC2抗體稀釋劑100μL，37℃反應(yīng)1 h，PBS洗滌3次，每孔加生物素HRP工作液100μL，37℃溫育25 min，上述步驟反復(fù)5次，每孔加入90μL TMB底物顯色液，37℃避光孵育20 min，最后每孔加停止液50μL，在酶標(biāo)儀450 nm波長處測量各孔的光密度（OD）值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算HDAC2水平。

1.3.6 Western blot檢測肺組織HDAC2和VEGF蛋白表達水平 取左肺組織100 mg，PBS充分清洗后提取蛋白，BCA法測定樣品蛋白濃度。每孔40μg行SDS-PAGE電泳（濃縮膠80 V、分離膠120 V），300 mA恒流轉(zhuǎn)膜后將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液室溫封閉1 h。棄去封閉液，分別加入兔抗大鼠一抗HDAC2（1∶1 000）、VEGF（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）4℃孵育過夜，回收稀釋的一抗，TBST洗滌3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶3 000），室溫孵育30 min，TBST洗滌4次，每次5 min。滴加新鮮配制的ECL發(fā)光液，于暗室曝光、顯影、定影。

1.3.7 qPCR檢測肺組織HDAC2mRNA表達 取新鮮左肺上葉組織，提取總RNA后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進行qPCR擴增目的基因。引物序列見表1。qPCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法計算HDAC2相對表達量。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法，兩變量間相關(guān)性使用Pearson法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況及體質(zhì)量變化 經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后各組大鼠一般情況良好，進食攝水正常，毛發(fā)顏色明亮光澤。分組干預(yù)2周后，空白對照組、阿托伐他汀鈣組大鼠一般情況良好，無特殊改變，COPD組大鼠出現(xiàn)間斷喘息、咳嗽，呼吸急促。干預(yù)6周后，空白對照組無明顯改變，食欲正常，精神狀態(tài)良好；COPD組大鼠進食減少，精神狀態(tài)欠佳，毛發(fā)變黃、脫落，伴明顯呼吸急促、喘息、呼吸困難；阿托伐他汀鈣組大鼠間斷咳嗽，無明顯呼吸急促等癥狀，毛發(fā)稍變黃，精神狀態(tài)良好。實驗初期各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在第2、4、6周時，與空白對照組相比，COPD組大鼠體質(zhì)量下降（P＜0.05）；與COPD組相比，阿托伐他汀鈣組大鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05），見表2。

2.2 各組肺組織病理改變

2.2.1 HE染色 空白對照組可見肺血管及氣道周圍組織形態(tài)正常，炎性細胞較少，炎癥評分降低。COPD組氣管壁明顯增厚，肺組織、氣管及血管周圍有大量炎性細胞聚集，肺血管平滑肌增生明顯，肺間隔明顯增厚，炎癥評分較空白對照組升高。阿托伐他汀鈣組肺氣管壁以及肺氣管周圍炎性細胞浸潤較COPD組有較大改善，肺血管平滑肌增生程度低于COPD組，炎性細胞減少，但較COPD組炎癥評分降低。見圖1、2，表3。

Tab.2 Changes of body weights in different time points of the three groups of rats表2 3組大鼠各時期體質(zhì)量的變化（n=6，g，±s）

Tab.2 Changes of body weights in different time points of the three groups of rats表2 3組大鼠各時期體質(zhì)量的變化（n=6，g，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與COPD組比較，P＜0.05

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2.2.2 維多利亞藍+VG染色 空白對照組大鼠動脈血管壁正常；COPD組動脈血管周圍出現(xiàn)完整彈力板，動脈肌性化改變明顯；阿托伐他汀鈣組動脈血管壁增生較COPD組明顯減輕，未出現(xiàn)完整內(nèi)外彈力板。與空白對照組比較，COPD組、阿托伐他汀鈣組大鼠肺血管WA%、WT%明顯增加，與COPD組相比，阿托伐他汀鈣組肺血管重構(gòu)程度減輕，WA%、WT%下降（P＜0.05），見圖3、表3。

Tab.3 Changes of pulmonary vascular remodeling indicators in the three groups表3 各組大鼠肺血管重塑指標(biāo)的改變 （n=6，±s）

Tab.3 Changes of pulmonary vascular remodeling indicators in the three groups表3 各組大鼠肺血管重塑指標(biāo)的改變 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與COPD組比較，P＜0.05

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2.3 3組大鼠血清HDAC2含量比較 ELISA結(jié)果顯示，與空白對照組比較，COPD組大鼠血清HDAC2含量明顯降低（P＜0.05）；與COPD組比較，阿托伐他汀鈣組血清HDAC2含量升高（P＜0.05）。見表4。

2.4 3組大鼠肺組織中HDAC2、VEGF表達水平比較 與空白對照組比較，COPD組肺組織中HDAC2 mRNA和蛋白表達水平下降，VEGF蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與COPD組比較，阿托伐他汀鈣組大鼠肺組織HDAC2 mRNA和蛋白表達升高（P＜0.05），VEGF表達降低（P＜0.05）。見圖4、表4。

Tab.4 Comparison of HDAC2 and VEGF expression levels in serum and lung tissues of rats between the three groups表4 3組大鼠血清和肺組織中HDAC2及VEGF表達水平比較 （±s）

Tab.4 Comparison of HDAC2 and VEGF expression levels in serum and lung tissues of rats between the three groups表4 3組大鼠血清和肺組織中HDAC2及VEGF表達水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與COPD組比較，P＜0.05

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Fig.4 Expressions of HDAC2 and VEGF in lung tissues of the three groups圖4各組肺組織中HDAC2、VEGF的表達

3 討論

COPD是臨床常見的呼吸系統(tǒng)內(nèi)科疾病，以小氣道炎癥為基礎(chǔ)病理改變［12］。目前認(rèn)為COPD患者氣道炎癥由炎癥相關(guān)基因過表達導(dǎo)致，其表達由組蛋白乙?；福℉AT）和脫乙?；福℉DAC）共同調(diào)節(jié)［13-14］。HDAC可通過逆轉(zhuǎn)核心組蛋白表達來抑制炎癥相關(guān)基因的表達，而HDAC2作為HDAC家族的主要成員，是COPD發(fā)病涉及的主要亞型。在COPD進展時，外周血及肺組織中HDAC2表達逐漸減少，導(dǎo)致染色質(zhì)輔助因子無法輔助染色質(zhì)的致密卷曲、轉(zhuǎn)錄，激活轉(zhuǎn)錄因子RORγt無法完成乙?；偁幮栽黾雍艘蜃樱∟F）-κB乙?；?，產(chǎn)生大量白細胞介素（IL）-8、IL-17、腫瘤壞死因子（TNF）-α等炎性因子和VEGF、內(nèi)皮素-1（ET-1）等血管內(nèi)皮因子，導(dǎo)致氣道、肺實質(zhì)、肺血管的炎癥反應(yīng)，促使肺血管內(nèi)皮功能紊亂，肺血管收縮、舒張功能受損，形成肺血管重塑［15-16］。

阿托伐他汀鈣是常用的調(diào)脂藥物，主要通過抑制脂質(zhì)合成中的經(jīng)甲基戊二酸單酰輔酶A（HMGCoA）還原酶的合成，使得甲羥戊酸和膽固醇合成減少。除了降血脂以外，阿托伐他汀可減輕COPD患者氣道炎癥、減少氣道黏性分泌物，緩解氣道高反應(yīng)性，改善COPD患者肺功能［17］。He等［18］證實阿托伐他汀可以抑制肺組織炎癥進一步加重，其機制可能與減少甲羥戊酸和膽固醇合成，同時減少了三羧酸循環(huán)中三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白（GTP）生成，遏制了炎性因子C反應(yīng)蛋白（CRP）的釋放有關(guān)［19］。在本研究中，與COPD組大鼠比較，阿托伐他汀鈣組肺血管周圍炎性細胞聚集減少，血管內(nèi)皮損傷、肺血管炎癥減輕，WA%、WT%等肺血管重塑指標(biāo)下降明顯，VEGF表達減少，提示阿托伐他汀可以改善肺血管炎癥及肺血管重塑水平。本研究還發(fā)現(xiàn)，COPD狀態(tài)下大鼠體內(nèi)HDAC2水平降低，經(jīng)阿托伐他汀干預(yù)后HDAC2水平增加，支氣管炎癥明顯減輕，這與付曉等［20］和Lai等［21］的研究結(jié)果一致。結(jié)合本實驗結(jié)果及文獻報道，推測阿托伐他汀在抑制HMG-CoA還原酶生成的同時，減少GTP含量，抑制NF-κB乙?；答佌{(diào)節(jié)提高HDAC2的表達［22］，由于NF-κB乙酰化減少，各種炎性因子釋放減少［23］，使得肺動脈血管炎癥明顯減輕。此外阿托伐他汀還能改善血管內(nèi)皮細胞功能，維持血管通透性和舒縮功能，進一步穩(wěn)定肺血管內(nèi)環(huán)境。另外，本實驗發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以抑制肺組織中VEGF因子的表達，證實阿托伐他汀可以通過抑制VEGF阻止肺血管病理性增生，改善肺血管重構(gòu)程度，但其機制是阿托伐他汀促使HDAC2含量增加間接減少VEGF的產(chǎn)生有關(guān)，還是阿托伐他汀直接作用血管內(nèi)皮細胞抑制VEGF釋放，尚不明確，需進一步探討。

綜上所述，阿托伐他汀可以一定程度上改善COPD肺血管炎癥及肺血管重塑，其機制可能是通過提高HDAC2的表達水平，抑制炎癥相關(guān)基因表達，減少炎性因子、肺血管內(nèi)皮因子的釋放。

Fig.1 Pulmonary airway changes in contorl,COPD and atorvastatin groups(HE staining,×100)圖1 空白對照組、COPD組、阿托伐他汀鈣組氣道改變（HE染色，×100）

Fig.2 Pulmonary vascular changes in contorl,COPD and atorvastatin groups(HE staining,×100)圖2 空白對照組、COPD組、阿托伐他汀鈣組肺血管改變（HE染色，×100）

Fig.3 Pulmonary vascular changes in contorl,COPD and atorvastatin groups(Victoria blue+VG staining,×200)圖3 空白對照組、COPD組、阿托伐他汀鈣組肺血管改變（維多利亞藍+VG染色，×200）