多靶點酪氨酸激酶抑制劑阿西替尼治療肝纖維化的作用與機制

劉司南，黃子超，畢文超，崔瑞霞，曲 凱，劉 昌

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 710061；2. 陜西省腫瘤醫(yī)院，陜西西安 710061；3. 西安交通大學(xué)附屬紅會醫(yī)院，陜西西安 710054)

肝硬化是世界范圍內(nèi)的重要健康問題，尚缺乏有效治療[1-2]。肝移植是目前唯一根治方法，但并不能滿足臨床需求[3]。肝纖維化是肝硬化的早期狀態(tài)，是肝臟損傷后，炎癥遷延所致的過度修復(fù)反應(yīng)[4-5]。已證實肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。肝臟損傷后，炎癥介質(zhì)促進(jìn)HSC活化、增生[6]，產(chǎn)生膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular metrics, ECM)，引起肝臟結(jié)構(gòu)重塑[7-8]。因此，抑制活化的HSC成為治療肝纖維化的重要切入點[9]。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等多種細(xì)胞因子，與HSC表面的特異受體結(jié)合會激活HSC[10]。其中，PDGF是HSC最強的有絲分裂原，通過與HSC表面的受體酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinases, RTKs)結(jié)合，促進(jìn)HSC活化、增殖[11]，VEGF作用機制與其相仿。

阿西替尼(Axitinib)是新一代強效的多靶點酪氨酸激酶受體抑制劑，可靶向阻滯PDGFR和VEGFR-1/2/3，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，目前已應(yīng)用于腎癌、結(jié)腸癌的治療[12-14]。據(jù)此推斷其可能影響活化HSC的細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡而在肝纖維化治療中發(fā)揮作用。本研究通過觀察阿西替尼對CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝組織纖維增生的影響以及對體外HSC系(LX2)細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡的影響，探究其在抗肝纖維化治療中的作用，為肝硬化的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗動物阿西替尼(AG-013736)購自美國輝瑞公司。8周齡C57BL/6小鼠48只(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供)，體質(zhì)量25～35 g，清潔級，按12 h/12 h明暗周期飼養(yǎng)。人肝細(xì)胞系LO2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，人LX2購自湖南湘雅醫(yī)學(xué)院中心實驗室細(xì)胞庫。

1.2 造模及分組與取材應(yīng)用四氯化碳(carbon tetrachloride, CCL4)橄欖油溶液2 mL/kg腹腔注射，每周2次，連續(xù)4周，誘導(dǎo)小鼠肝臟纖維化模型。實驗分為6組(各組n=8)。對照組僅腹腔注射2 mL/kg的橄欖油，每周2次，連續(xù)4周；CCl4造模2周組、4周組，用CCl4橄欖油溶液分別造模處理2周、4周后處死，阿西替尼治療1周組、2周組于造模4周時給予阿西替尼CMC稀釋液600 μg/只灌胃，每周2次，分別共給藥1周、2周時處死；CMC對照組于造模4周時給予CMC 10 mg/mL的工作液灌胃2周(2次/周)。于各組處理終點處死小鼠后取材肝組織，以100 mL/L甲醛固定，制作石蠟切片，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 肝組織切片染色對各組切片進(jìn)行HE染色與Masson染色，顯微鏡下觀察。光鏡下，膠原纖維被染成藍(lán)綠色，每樣本隨機選取15個高倍視野(200×)，采用Motic Med數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行膠原纖維陽性面積半定量，分析判斷膠原面積密度變化。

α-SMA免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片脫蠟，修復(fù)抗原，30 mL/L過氧化氫阻斷后，鼠單抗α-SMA(美國Santa Cruz公司)，4 ℃過夜，按照SP法試劑盒(中山生物)說明書操作，DAB(中杉金橋)顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封固，顯微鏡下拍照觀察蛋白定位、評分、陽性染色面積分析。結(jié)果判定：每張切片均勻區(qū)域隨機選取5個高倍視野，細(xì)胞數(shù)≥1 000/視野。觀察每個視野細(xì)胞中的陽性細(xì)胞以及染色強弱度，計算組織切片免疫組化得分(immunohistochemical score, IHS)，根據(jù)Remmele和Stegner提出的免疫反應(yīng)積分(IRS)打分法，使用染色強度(Sl)及陽性細(xì)胞百分比(PP)計算：公式即IRS=SI×PP[15]。

1.4 MTT檢測細(xì)胞活性復(fù)蘇LO2細(xì)胞及LX2細(xì)胞后培養(yǎng)、傳代，同步后種入96孔板進(jìn)行實驗分組。調(diào)零組僅加入培養(yǎng)基，對照組為培養(yǎng)基+同步化細(xì)胞，不同干預(yù)濃度的藥物實驗組為培養(yǎng)基+某濃度阿西替尼+同步化細(xì)胞，于培養(yǎng)48、72 h時分別取96孔板，加入20 μL MTT溶液，再培養(yǎng)4 h，終止并加入150 μL DMSO，震蕩混勻，放入酶標(biāo)儀檢測。每組設(shè)置5個復(fù)孔，計算各組的平均值，計算IC50，繪制抑制率曲線。

1.5 Annexin-V/PI聯(lián)合標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡LO2細(xì)胞及LX2細(xì)胞同步化后種于6孔板，分為溶劑對照組及62.5、250、500、1 000 μmol/L阿西替尼組分別進(jìn)行干預(yù)。于48、72 h時收集細(xì)胞，漂洗后進(jìn)行Annexin-V染色(按照Annexin-V/PI聯(lián)合標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測試劑盒進(jìn)行)，將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液。置于488 nm波長激發(fā)光的流式細(xì)胞儀上進(jìn)行凋亡檢測，上機測定時獲取1×104個以上細(xì)胞，重復(fù)2次后分析結(jié)果。

1.6 Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)按照1.4項中分組干預(yù)細(xì)胞48 h，裂解細(xì)胞離心后收集蛋白并測定濃度。制備100 g/L聚丙烯酰胺凝膠，上樣后90 V電泳90 min后，于250 mA，濕轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜，100 g/L PBST脫脂牛奶封閉2 h，一抗孵育過夜(Caspase3，1∶1 000；Fas，1∶3 000；Bcl-2，1∶2 000；Caspas8，1∶500；β-actin，1∶5 000)，PBST洗膜3次，10 min/次，二抗孵育1 h(先鋒生物，1∶10 000)，再次洗膜3次，步驟同前。最后進(jìn)行暗室發(fā)光并采集圖像，應(yīng)用蛋白灰度與內(nèi)參灰度值的比值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 CCL4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的組織病理學(xué)觀察肝臟組織HE染色顯示(圖1)：對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常。CCL4造模2周組肝組織正常小葉結(jié)構(gòu)破壞，匯管區(qū)及中央靜脈增多，炎細(xì)胞浸潤；造模4周組肝細(xì)胞大片壞死并被白色纖維結(jié)締組織取代，小葉結(jié)構(gòu)消失。

圖1 小鼠肝臟組織病理學(xué)HE染色

2.2 Masson染色結(jié)果Masson染色結(jié)果顯示，與對照組相比，CCL4造模組可見膠原纖維為主的ECM明顯增多，分布于匯管區(qū)及中央靜脈周圍，并伸入肝小葉內(nèi)包繞肝細(xì)胞形成假小葉，肝小葉結(jié)構(gòu)喪失；阿西替尼治療1周組和治療2周組的小鼠肝組織中央靜脈周圍和匯管區(qū)膠原纖維較前減少；CCL4造模2周組、4周組的膠原面積密度半定量測定分別為(13.67±0.68)%、(24.43±4.21)%，明顯高于對照組的(1.73±0.31)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；阿西替尼治療1周組及治療2周組分別為(17.63±1.51)%、(11.15±1.242)%，明顯低于造模4周組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而CMC對照組的膠原面積密度為(27.09±3.07)%，與造模4周組比較差異不明顯(P>0.05，圖2)。

2.3 各組小鼠肝組織中α-SMA的表達(dá)變化免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CCL4造模2周組、4周組的小鼠肝臟組織α-SMA 陽性染色面積比率分別為(4.92±0.30)%、(30.62±9.14)%，免疫反應(yīng)積分(IRS)分別為(1.6±0.2)和(5.0±0.4)分；而阿西替尼治療1周組、2周組陽性面積比率及免疫反應(yīng)積則分別為(11.12±0.31)%、(6.93±1.08)%和(3.07±0.42)、(1.67±0.42)分，α-SMA陽性表達(dá)呈下降趨勢。與CCL4造模4周組及CMC對照組[(28.52±6.23)%、(5.27±0.11)分]的差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 小鼠肝組織α-SMA免疫組化染色(200×)

2.4 阿西替尼對肝細(xì)胞活性及凋亡的作用MTT實驗結(jié)果顯示，阿西替尼各濃度組間的LX2抑制率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。干預(yù)48、72 h，阿西替尼對LX2活性的50%抑制濃度(IC50)分別為127.6、284.5 nmol/L。LX2抑制率的擬合曲線顯示，阿西替尼對LX2細(xì)胞活性的48、72 h抑制作用均隨著藥物濃度增高而逐漸增高(圖4A、4B)。而對LO2組細(xì)胞活性抑制作用不顯著，僅高濃度組(1 000 nmol/L)同未干預(yù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

流式細(xì)胞儀檢測顯示，與對照溶劑組比較，250 nmol/L阿西替尼干預(yù)組48 h時的LX2細(xì)胞凋亡率即開始升高，且凋亡率隨著各干預(yù)組濃度增加而增高，72 h時抑制作用更加明顯(圖4C)。而LO2組干預(yù)48、72 h，低濃度各組凋亡率與對照溶劑組差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，僅濃度達(dá)500、1 000 nmol/L時凋亡率與溶劑對照組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4D)。

圖2 各組肝臟組織Masson染色(200×)及膠原沉積面積(面積密度%)的比較Fig.2 Masson staining (200×) and collagen deposition area (area density%) in liver tissue膠原沉積染色為藍(lán)綠色。A:對照組;B:CCL4造模2周組;C:CCL4造模4周組;D:CMC對照組;E:阿西替尼治療1周組;F:阿西替尼治療2周組;G:統(tǒng)計學(xué)分析。ns:兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 阿西替尼作用于肝星狀細(xì)胞系LX2和肝細(xì)胞系LO2的影響

2.5 LX2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化Western blotting檢測顯示，與溶劑對照組比較，阿西替尼干預(yù)LX248 h，自250 nmol/L濃度組開始，各組Fas、Caspase-8及Caspase-3表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；各濃度組Fas、Caspase-8以及Caspase-3蛋白表達(dá)均上調(diào)，而Bcl-2明顯下調(diào)，且與藥物濃度存在依賴關(guān)系；而LO2細(xì)胞株各濃度組蛋白表達(dá)與對照組差異不明顯，僅1 000 nmol/L高濃度組有差異(P<0.05，圖5)。

圖5 Western blotting檢測阿西替尼處理的LX2(A)及LO2細(xì)胞(B)中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

HSC是肝纖維化反應(yīng)的重要效應(yīng)器，也是細(xì)胞因子的主要來源和靶點[16]。慢性肝病中，細(xì)胞因子的釋放刺激HSC活化和增殖，通過自分泌或旁分泌方式釋放PDGF等因子并表達(dá)相應(yīng)的受體，導(dǎo)致膠原等ECM過量沉積，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生進(jìn)展[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，靜止的HSC并不表達(dá)PDGFR，僅當(dāng)其活化后才會表達(dá)[19-21]。抑制酪氨酸激酶受體PDGFR、VEGFR活性，可能引起活化的HSC的系列變化，進(jìn)而影響肝纖維化的進(jìn)一步進(jìn)展。阿西替尼為一種多靶點酪氨酸激酶受體抑制劑，能夠阻止多個酪氨酸激酶受體活性，可能誘導(dǎo)活化的HSC凋亡，發(fā)揮抗纖維化作用。本研究發(fā)現(xiàn)，CCL4可以誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，且隨著時間延長，肝纖維化程度逐漸加重。同時，Masson染色結(jié)果顯示，應(yīng)用阿西替尼治療組小鼠肝臟膠原沉積面積較溶劑對照組和造模組大幅下降，提示阿西替尼可以改善CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化模型的膠原組織增生狀況。這一結(jié)果與MEJIAS等[19]應(yīng)用索拉非尼治療膽管結(jié)扎(BDL)大鼠的實驗結(jié)果類似。

活化的HSC產(chǎn)生膠原等ECM的累積可導(dǎo)致肝纖維化形成。為明確阿西替尼治療時膠原沉積減少是否與其影響活化的HSC有關(guān)，進(jìn)而應(yīng)用免疫組化實驗標(biāo)記已知的HSC的活化標(biāo)記物α-SMA觀察阿西替尼干預(yù)小鼠肝臟活化HSC的表達(dá)，結(jié)果顯示，阿西替尼組肝組織α-SMA陽性細(xì)胞(活化的HSC)面積比率較CCL44周造模組及CMC對照組顯著降低，這提示阿西替尼通過使活化的HSC減少而抑制肝纖維化進(jìn)程。

酪氨酸激酶抑制劑如尼羅替尼、索拉非尼等能夠通過影響活化HSC而發(fā)揮一定的抗肝纖維化作用[22-23]。本研究進(jìn)一步通過MTT實驗證實阿西替尼嚴(yán)重抑制肝星狀細(xì)胞系LX2的細(xì)胞活性，且效應(yīng)具有濃度依賴性。據(jù)此推測，阿西替尼可能通過影響活化HSC的活性發(fā)揮抗纖維化作用。研究報道，活化的HSC中NF-κB通路激活，誘導(dǎo)抗凋亡蛋白如Bcl-2等表達(dá)升高，從而抵抗細(xì)胞死亡刺激[24]。有文獻(xiàn)報道，誘導(dǎo)活化的HSC凋亡可減輕肝纖維化[25]，因此，誘導(dǎo)HSC細(xì)胞死亡對肝纖維化的治療具有潛在價值。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度阿西替尼干預(yù)LX2后，其凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)明顯增加。這證實了阿西替尼可誘導(dǎo)活化的HSC發(fā)生凋亡。本研究還檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)阿西替尼誘導(dǎo)HCS凋亡的機制可能是通過Fas/Fas-L激活一系列Caspase家族的酶聯(lián)反應(yīng)和下調(diào)Bcl-2/Bax而實現(xiàn)的。此外，實驗設(shè)置的LO2對照組被阿西替尼抑制的IC50范圍遠(yuǎn)大于LX2，且僅較高濃度時凋亡相關(guān)蛋白才顯示出差異。這提示在一定濃度范圍內(nèi)，阿西替尼治療較為安全。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是因為HSC激活后其表面表達(dá)PDGFR、VEGFR等多種酪氨酸受體激酶，導(dǎo)致其對于阿西替尼藥物敏感性增高所致，但尚需進(jìn)一步的實驗進(jìn)行驗證。

綜上所述，本研究初步驗證了阿西替尼可以通過抑制活化的HSC活性，誘導(dǎo)其凋亡，發(fā)揮抗肝纖維化作用，且在合適的劑量范圍內(nèi)阿西替尼對肝星狀細(xì)胞的抑制作用不會引起正常肝細(xì)胞的損傷和凋亡。這為阿西替尼治療肝纖維化的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，但還需進(jìn)一步實驗研究其具體機制和治療安全性。